Studies on Sulfolobus acidocaldarius biofilms and enhancement of its expression system
Im Hauptteil dieser Arbeit (Teil I) werden Studien zum thermoacidophilen Crenarchaeon S. acidocaldarius vorgestellt. Kapitel 4.1 und 4.2 beschäftigen sich mit der Untersuchung von Biofilmbildung und der Zusammensetzung der EPS-Matrix und der darin enthaltenen Exopolysaccharide.
Kapitel 4.1 konzentriert sich auf die Reaktion von S. acidocaldarius auf Lösungsmittelstress, insbesondere auf die Exposition gegenüber 1-Butanol. Es wurden verstärkte Biofilmbildung und Veränderungen in der EPS-Matrix festgestellt. In Anwesenheit von 1-Butanol wiesen S. acidocaldarius Biofilme eine dichtere und höhere turmartige Struktur auf und es wurden erhöhte Mengen an extrazellulären Kohlenhydraten und Proteinen nachgewiesen. Im Vergleich zu planktonischen Zellen zeigten Biofilmzellen eine erhöhte Toleranz gegenüber 1- Butanol. Außerdem wurden bei erhöhten 1-Butanol-Konzentrationen drei verschiedene Zellmorphotypen beobachtet. Die Transkriptomanalyse zeigte, dass die Expression von Biofilm-Transkriptionsregulatoren, die an der Regulation der Biofilmbildung in S. acidocaldarius beteiligt sind, verändert war. Des Weiteren wurde eine verringerte Expression von Archaellum-Untereinheiten, Zellhüllenstrukturen, Membranproteinen und Immun- und Abwehrsystemen als Reaktion auf die Exposition gegenüber 1-Butanol festgestellt. Die Expression von Genen, welche in der Zellteilung und/oder Vesikelbildung involviert sind, war erhöht. Insgesamt wurde eine globale Reaktion zum Schutz auf Populationsebene identifiziert. Im Vergleich zu anderen Archaeen zeigte S. acidocaldarius eine bemerkenswert hohe Toleranz gegenüber 1-Butanol, die der Toleranz von mesophilen Organismen, wie dem 1-Butanol produzierenden Organismus C. acetobutylicum ähnelte. Die in dieser Arbeit präsentierten Kenntnisse über die Reaktion und Toleranz von S. acidocaldarius gegenüber organischen Lösungsmitteln könnte in Zukunft für dessen Etablierung und Anwendung in biotechnologischen Prozessen von Bedeutung sein.
Kapitel 4.2 bietet detaillierte Einblicke in die Zusammensetzung und Dynamik der EPS-Matrix von S. acidocaldarius Biofilmen. Zunächst wurde ein alternatives Protokoll zur Kultivierung von Biofilmen etabliert, dass die Generierung großer Mengen an Biofilmmasse ermöglichte. Dabei wurden S. acidocaldarius Biofilme auf der Oberfläche von Membranfiltern kultiviert. EPS Biopolymere wurden isoliert und die Summenparameter der extrazellulären Kohlenhydrate, Proteine und DNA definiert. Die Exopolysaccharidfraktion der EPS-Proben wurde durch den enzymatischen Verdau anderer EPS-Bestandteile (Nukleinsäuren und Proteine) erhalten, und ihre Monosaccharidzusammensetzung und Größe wurden mittels analytischer Methoden bestimmt. Erstmals wurde die Molekularmasse eines crenarchaellen Exopolysaccharids ermittelt und diese betrug im Mittel 7,1 x 104 Da für S. acidocaldarius Biofilme. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Biofilmbildung und EPS-Zusammensetzung durch die Zugabe verschiedener Zucker zum Wachstumsmedium beeinflusst werden. Insgesamt bietet diese Arbeit methodische Werkzeuge, die zukünftige Forschungen zur Biosynthese und Sekretion von Exopolysacchariden ermöglichen.
Kapitel 4.3 präsentiert die Optimierung und Anwendung von S. acidocaldarius als archaelles Expressionssystem. In dieser Arbeit wurde die plasmidbasierte Produktion eines Reporterproteins durch den Einbau von 5'-UTR-Sequenzen in verfügbare Expressionsvektoren deutlich verbessert. Dabei erwies sich die 5'-UTR-Sequenz des Albakodierenden Gens aus dem Genom von S. acidocaldarius als am effizientesten und zuverlässigsten, und konnte die Produktion des Esterase-Reporterproteins um das Vierfache steigern. Alba 5'-UTR-modifizierte Expressionsplasmide wurden erfolgreich für die Produktion von archaellen Glykosyltransferasen eingesetzt. Diese Studie betont die Bedeutung der 5'- UTR als relevantes Element archaeller Expressionsvektoren und erweitert das Anwendungspotenzial von S. acidocaldarius als archaelles Expressionssystem. In Zukunft könnte die Anwendung der 5'-UTR-modifizierten Expressionsvektoren die Synthese weiterer thermophiler oder archaeller Proteine erhöhen oder ermöglichen.
Abschließend wird in Teil II dieser Arbeit (Kapitel 4.4) ein fortgeschrittener Arbeitsablauf zur Optimierung von Enzymkaskaden und Ganzzellkatalyse vorgestellt. Hierbei wird eine Kombination aus enzymatischer Charakterisierung und Modellierung von Stoffwechselwegen für die Konstruktion und Validierung eines quantitativen Modells vorgeschlagen, das die Entwicklung von Enzymkaskaden und die Leistungssteigerung dieser Stoffwechselwege unterstützt. Das Modell wird durch Wiederholungen von klassischen enzymkinetischen Experimenten, Modellvorhersagen und -validierungen aufgebaut und kalibriert. Dabei werden mögliche Produkthemmungen sowie allosterische oder Cofaktor-basierte Regulierungen berücksichtigt. In der Vergangenheit wurde dieser Arbeitsablauf bereits erfolgreich auf in vitro Enzymkaskaden des Weimberg-Stoffwechselwegs von C. crescentus für die Biokonversion von D-Xylose angewendet. In Zukunft könnte dieser Ansatz die wissenschaftliche Gemeinschaft bei der Optimierung anderer metabolischer Strategien zur Umwandlung von DXylose-haltiger Biomasse unterstützen.
In the main part of this thesis (Part I), studies on the thermoacidophilic crenarchaeon S. acidocaldarius are presented. Chapters 4.1 and 4.2 contain research on biofilm formation as well as EPS and exopolysaccharide composition of S. acidocaldarius biofilms.
Chapter 4.1 focusses on the response of S. acidocaldarius to solvent stress, exemplified by 1- butanol exposure. Increased biofilm formation and changes in the EPS matrix were found to be primary responses. In the presence of 1-butanol, biofilms exhibited a denser and higher tower-like architecture, and increased amounts of extracellular carbohydrates and EPS proteins were detected. In addition, biofilm cells exhibited an increased 1-butanol tolerance compared to single, planktonic cells. At elevated 1-butanol concentrations, three different cell morphotypes were observed. Transcriptome analysis revealed the regulation of biofilm transcriptional regulators involved in biofilm formation in S. acidocaldarius and downregulation of archaellum subunits in response to 1-butanol exposure. Apart from that, decreased expression of cell envelope structures, membrane proteins, immune and defense systems, and increased cell division and/or vesicle formation were observed. Overall, a global response for the protection at population level was indicated. Compared to other archaea, S. acidocaldarius showed a remarkably higher tolerance to 1-butanol, which was in a similar range as reported for mesophilic organisms, such as the 1-butanol producing strain C. acetobutylicum. In the future, knowledge of the response and tolerance of S. acidocaldarius to organic solvents may be important for the establishment and its application in biotechnological processes.
Chapter 4.2 provides detailed insights into the EPS composition and dynamics of S. acidocaldarius biofilms. An alternate biofilm cultivation protocol was established to obtain large amounts of biofilm mass by growing S. acidocaldarius biofilms on the surface of membrane filters. EPS isolation was performed and sum parameters of extracellular carbohydrate, protein, and DNA were defined. The exopolysaccharide fraction of EPS samples was received by the enzymatic digestion of other EPS components (nucleic acids and proteins) and its monosaccharide composition as well as size were defined by advanced analytical methods. For the first time, the molecular mass of a crenarchaeal exopolysaccharide is reported with an average mass of 7.1 x 104 Da for S. acidocaldarius biofilms. In addition, biofilm formation as well as EPS composition were shown to be affected by the supplementation of different sugars to the growth medium. Overall, this work provides methodological tools that enable further research on the biosynthesis and secretion of exopolysaccharides. Chapter 4.3 refers to the optimization and application of S. acidocaldarius as archaeal expression host. Plasmid-based production of a reporter protein was significantly enhanced by the insertion of 5’-UTR sequences into an available, sugar-inducible expression vector. In this regard, the 5’-UTR sequence of the Alba-encoding gene from the genome of S. acidocaldarius proved to be most reliable and efficient and was shown to increase the production of esterase reporter protein fourfold. Alba 5’-UTR-modified expression plasmids were successfully used for the production of archaeal glycosyltransferases. This study highlights the significance of 5’- UTRs as a relevant feature in archaeal expression vectors. The application of 5’-UTR-modified expression vectors could increase or enable the synthesis of thermophilic or archaeal proteins and expand the scope of S. acidocaldarius as an archaeal expression host in the future.
Finally, in Part II of this thesis (Chapter 4.4), an advanced workflow for the optimization of enzyme cascades and whole cell catalysis is presented. In this review article, a combination of enzyme kinetic characterization and pathway modelling is proposed for the construction and validation of a quantitative model that supports enzyme cascade design and pathway performance. The model is constructed and calibrated by iterations between classic enzyme kinetic experiments and model prediction and validation, including the characterization of possible product inhibition and allosteric or cofactor-based regulation. In the past, this approach has been successfully applied to in vitro enzyme cascades for D-xylose bioconversion via the Weimberg pathway of C. crescentus. In the future, it may assist the scientific community in the optimization of other metabolic engineering strategies for the conversion of D-xylose-containing biomass to achieve maximum biocatalytic efficiency and conversion rates independent of the platform organism.