Fatty acid and glycerol metabolism in Sulfolobus acidocaldarius and establishing new methods for identification of novel biocatalysts in the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium
The first part (Part I) dealt with the metabolism in the third domain of life, the Archaea. One characteristic feature of Archaea is their membrane composition that consists of isoprenoid side chains that are ether linked to G1P, in contrast to bacterial and eukaryotic membrane lipids that consist of FA side chains that are ester linked to G3P. This evolutionary differentiation of membrane structures between Archaea and Bacteria is regarded as the “lipid divide“ and raised up questions regarding the existence and the function of FAs in Archaea. Since one of the main functions of FAs as key part of membrane phospholipids and thus of cell structure in Bacteria and Eukaryotes is substituted by isoprenoids in Archaea, the presence and function of FAs in Archaea remains unknown. In this work it was shown that the archaeal model organism S. acidocaldarius contains a fully functional largely bacterial-like β oxidation pathway for FA degradation which was biochemically characterized in detail. Furthermore, a potential novel pathway for FA synthesis acting completely independent from β oxidation was identified and characterized. Furthermore, this work elucidated the utilization of glycerol by S. acidocaldarius and compares its breakdown with known pathways from Bacteria and Eukaryotes and discusses how thermoacidophilic Archaea such as S. acidocaldarius have evolved strategies to mitigate metabolic instabilities associated with high temperatures.
In chapter 3.1 the FA metabolism of S. acidocaldarius was elucidated by characterizing homologous enzymes of a bacterial-like β oxidation encoded by gene cluster saci_1103-1126. Here the functions of multiple acyl-CoA synthetases (FA activation), as well as acyl-CoA dehydrogenases (ACAD), bifunctional 3(S)-hydroxyacyl-CoA dehydrogenases/enoyl-CoA hydratases (HCDH/ECH) and β-ketothiolases (KT) were confirmed via heterologous production and characterization. All single enzymes put together in vitro were able to fully degrade short to medium chain acyl-CoA esters to acetyl-CoA in a functional β oxidation cycle. Thus, it was shown that S. acidocaldarius encodes enzymes for fully functional β oxidation spiral degrading acyl-CoAs up to chain lengths of C8 and this pathway shows some unusual features with respect to the ETF, the HCDH/ECH bifunctional enzyme and the “archaeal type” KTs.
In contrast to what was previously suggested this β oxidation cycle was not reversible and is thus not responsible for FA synthesis in S. acidocaldarius. Instead, a potential novel pathway was studied, that would run independent of this β oxidation cycle. This putative anabolic pathway for FA synthesis shows a mosaic character with similarities to both bacterial (fabG, MaoC) and eukaryal (MDR enoyl thioester reductase) features mixed with unique archaeal properties (DUF35 domain/KT complexes, ACP independence). Candidates for all these enzymes were purified and biochemically characterized and were shown to be active against acyl-CoA intermediates with a chain length up to C8. Even though the function of FAs in Archaea is unknown this work provides a basic understanding of FA metabolism in Archaea and functions as a starting point for understanding the presence and significance of FA in Archaea.
Chapter 3.2 presents the elucidation of a pathway for glycerol degradation in S. acidocaldarius. Growth curves, transcriptomic, proteomic and metabolomic data show that S. acidocaldarius utilizes glycerol via the concerted activity of GK and G3PDH. Biochemical characterization shows the ATP dependent phosphorylation of glycerol by GK and quinone dependent oxidation of intermediately formed G3P to DHAP. In total, this work demonstrates that S. acidocaldarius utilizes glycerol as growth substrate and employs a conserved classical GK (homologous to GlpK) for glycerol phosphorylation. However, G3P oxidation is catalysed by a GlpA-subunit like FAD-dependent G3PDH (Saci_2032) lacking the B and C subunits of the classical, bacterial GlpABC complex. Instead, it shows an unusual type of membrane association facilitated by a small CoxG-related protein and thus, the recruitment of the GlpA-like Saci_2032 represents a novel function of CoxG homologues in Archaea.
Chapter 3.3 discusses how Archaea circumvent metabolic problems associated with growth at high temperatures such as formation and accumulation of toxic by/side products. Adaption strategies range from detoxification reactions that remove toxic by/side-products to the usage of different metabolic routes of common pathways that e.g., skip labile intermediates. In total it seems like (hyper)thermophilic Archaea employ three base strategies for mitigation: The concentration of unstable metabolites is reduced, different pathway topologies allow to circumvent labile intermediates, and damaged metabolites are continuously removed via novel metabolic pathways. This review furthermore suggests a significant influence of thermolabile intermediates as well as of promiscuous enzymes and pathways on the evolution of the metabolic network in (hyper)thermophilic Archaea.
The second part of this work in chapter 3.4 showcases the potential of using activity-based protein profiling (ABPP) biocatalyst screening technology in complex and biotechnologically relevant experimental settings, with the aim to rapidly identify promising lignocellulose degrading enzymes from complex protein samples: the secretome of the white rot fungus P. chrysosporium. The newly established workflow allowed for identification of a set of enzymes involved in lignocellulose metabolism while paying special attention to the often-neglected substrate bound proteins. The workflow allowed for enrichment of a wide array of serine hydrolases (SH) and β-cleaving glycoside hydrolases (GH). Protein production and biochemical characterization confirmed the function of two labeled and previously uncharacterized proteins Phchr2|126075 and Phchr2|2915237 as an acetyl-xylan esterase and endo cleaving β- glucanase, respectively. In addition, the results suggest that an unknown class of enzymes, DUF5127 domain proteins, could belong to a class of GH based on sequence analysis and enzyme assays. In total it was shown that a new established ABPP workflow can successfully be used for prescreening of enzymes and the involvement of these enzymes in fungal lignocellulose degradation was established. In theory this workflow could now be employed using different cultivation methods or different target organisms and could be advanced and refined further by the synthesis of novel ABPs.
Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Stoffwechsel in der dritten Domäne des Lebens, den Archaeen. Ein charakteristisches Merkmal der Archaeen ist ihre Membrankomposition, die aus Isoprenoid-Seitenketten besteht, die mit G1P über Etherbindungen verknüpft sind, im Gegensatz zu bakteriellen und eukaryotischen Membranlipiden, die aus Fettsäure-Seitenketten bestehen, die mit G3P verestert sind. Dieser Unterschied der Membranstrukturen zwischen Archaeen und Bakterien wird als "Lipid Divide" bezeichnet und wirft Fragen bezüglich der Existenz und Funktion von Fettsäuren in Archaeen auf. Da eine der Hauptfunktionen von Fettsäuren als Bestandteil von Membranphospholipiden und damit der Zellstruktur in Bakterien und Eukaryonten in Archaeen durch Isoprenoide ersetzt wird, ist die Funktion von Fettsäuren in Archaeen unbekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der archaeelle Modellorganismus S. acidocaldarius eine voll funktionsfähige, weitgehend bakterienähnliche β-Oxidation für den Abbau von Fettsäuren enthält, die biochemisch im Detail charakterisiert wurde. Darüber hinaus wurde ein potenzieller neuer Weg zur FettsäureSynthese identifiziert und charakterisiert, der völlig unabhängig zur β-Oxidation funktioniert. Außerdem wurde in dieser Arbeit die Verwertung von Glycerol durch S. acidocaldarius aufgeklärt und dieser Abbau mit bekannten Stoffwechselwegen von Bakterien und Eukaryoten verglichen und erörtert, wie thermoacidophile Archaeen wie S. acidocaldarius Strategien entwickelt haben, um metabolische Instabilitäten im Zusammenhang mit hohen Temperaturen abzumildern.
In Kapitel 3.1 wurde der FA-Stoffwechsel von S. acidocaldarius durch die Charakterisierung homologer Enzyme einer bakterienähnlichen β-Oxidation aufgeklärt, die von einem Gencluster (saci_1103-1126) kodiert werden. Dabei wurden die Funktionen von mehreren Acyl-CoASynthetasen sowie Acyl-CoA-Dehydrogenasen (ACAD), bifunktionellen 3(S)-HydroxyacylCoA-Dehydrogenasen/Enoyl-CoA-Hydratasen (HCDH/ECH) und β-Ketothiolasen (KT) durch heterologe Produktion und Charakterisierung bestätigt. Alle Enzyme zusammen waren in vitro in der Lage, kurz- bis mittelkettige Acyl-CoA-Ester in einem funktionellen β-Oxidationszyklus vollständig zu Acetyl-CoA abzubauen. Somit wurde gezeigt, dass in S. acidocaldarius Enzyme für eine voll funktionsfähige β-Oxidationsspirale kodiert sind, die Acyl-CoAs bis zu einer Kettenlänge von C8 abbauen können. Dieser β-Oxidationszyklus zeigte einige ungewöhnliche Merkmale in Bezug auf das ETF, das bifunktionelle HCDH/ECH-Enzym und auf archaeelle KTs. Im Gegensatz zu früheren Annahmen war diese β-Oxidation nicht reversibel und ist daher nicht für die Fettsäure-Synthese in S. acidocaldarius verantwortlich. Stattdessen wurde ein möglicher neuer Stoffwechselweg untersucht, der unabhängig von diesem β-Oxidationszyklus abläuft. Dieser mutmaßliche anabole Weg für die Fettsäure-Synthese zeigt einen Mosaikcharakter mit Ähnlichkeiten sowohl zu bakteriellen (fabG, MaoC) als auch zu eukaryontischen (MDR-Reduktase) Merkmalen, gemischt mit einzigartigen archaeellen Eigenschaften (DUF35-Domäne/KT-Komplexe, ACP-Unabhängigkeit). Die Kandidaten für alle diese Enzyme wurden gereinigt und biochemisch charakterisiert und ihre Funktion bestätigt.
In Kapitel 3.2 wird die Aufklärung eines Weges für den Glycerolabbau in S. acidocaldarius charakterisiert. Wachstumskurven, transkriptomische, proteomische und metabolomische Daten zeigten, dass S. acidocaldarius Glycerol über die Aktivität einer GK und G3PDH verwertet. Die biochemische Charakterisierung zeigte die ATP-abhängige Phosphorylierung von Glycerol durch GK und die Chinon-abhängige Oxidation von intermediär gebildetem G3P zu DHAP. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass S. acidocaldarius Glycerol abbaut und eine konservierte klassische GK (homolog zu GlpK) für die Glycerolphosphorylierung einsetzt. Die G3P-Oxidation wird jedoch von einer GlpA-Untereinheit katalysiert, die der FAD-abhängigen G3PDH (Saci_2032) ähnelt und der die Untereinheiten B und C des klassischen, bakteriellen GlpABC-Komplexes fehlen. Stattdessen zeigt es eine ungewöhnliche Art der Membranassoziation, die durch ein kleines CoxG-verwandtes Protein vermittelt wird, und somit stellt die Rekrutierung des GlpA-ähnlichen Saci_2032 eine neue Funktion von CoxGHomologen in Archaeen dar.
In Kapitel 3.3 wird erörtert, wie Archaeen metabolische Probleme umgehen, die mit dem Wachstum bei hohen Temperaturen verbunden sind, wie z. B. die Bildung und Anhäufung von toxischen Nebenprodukten. Die Anpassungsstrategien reichen von Entgiftungsreaktionen, die toxische Nebenprodukte entfernen, bis zur Nutzung verschiedener Stoffwechselwege, die z.B. labile Zwischenprodukte überspringen. Insgesamt scheinen (hyper)thermophile Archaeen drei grundlegende Strategien zur Schadensbegrenzung zu verwenden: Die Konzentration instabiler Metaboliten wird reduziert, verschiedene Stoffwechselwege ermöglichen die Umgehung labiler Zwischenprodukte, und geschädigte Metaboliten werden kontinuierlich über neue Stoffwechselwege entfernt. Diese Übersicht deutet außerdem auf einen signifikanten Einfluss von thermolabilen Zwischenprodukten sowie von promiskuitiven Enzymen und Stoffwechselwegen auf die Evolution des metabolischen Netzwerks in (hyper)thermophilen Archaeen hin.
Der zweite Teil dieser Arbeit in Kapitel 3.4 zeigt das Potenzial von ABPP für das Screening von Biokatalysatoren in einem komplexen und biotechnologisch relevanten experimentellen Umfeld, mit dem Ziel, vielversprechende lignozelluloseabbauende Enzyme aus einer komplexen Proteinprobe zu identifizieren: dem Sekretom des Weißfäulepilzes P. chrysosporium. Der neu entwickelte Arbeitsablauf ermöglichte die Identifizierung einer Reihe von Enzymen, die am Lignozellulosestoffwechsel beteiligt sind, wobei den oft vernachlässigten substratgebundenen Proteinen eine besondere Aufmerksamkeit geschenkt wurde. Dieser Arbeitsablauf ermöglichte die Anreicherung einer breiten Palette von Serinhydrolasen (SH) und β-spaltenden Glykosidhydrolasen (GH). Die Proteinproduktion und biochemische Charakterisierung bestätigte die Funktion von zwei zuvor nicht charakterisierten Proteinen Phchr2|126075 und Phchr2|2915237 als Acetyl-Xylan-Esterase bzw. endospaltende β-Glucanase. Darüber hinaus legen die Ergebnisse nahe, dass eine unbekannte Klasse von Enzymen, DUF5127-Domänenproteine, auf der Grundlage von Sequenzanalysen und Enzymtests zu einer Klasse von GH gehören könnten. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass ein neu etablierter ABPP-Arbeitsablauf erfolgreich für das Vorscreening von Enzymen eingesetzt werden kann und dass diese Enzyme am Lignocellulose-Abbau durch Pilze beteiligt sind. Theoretisch könnte dieser Arbeitsablauf nun mit anderen Kultivierungsmethoden oder anderen Zielorganismen eingesetzt und durch die Synthese neuartiger ABPs weiterentwickelt und verfeinert werden.