The effect of increased DSB complexity generated by combined treatment with Cisplatin and IR on the radiosensitization of lung cancer cell lines
With this present study, in search of strategies to enhance chemo-radiosensitivity of lung carcinoma cell lines, we aimed to evaluate the impact of combined treatment with cisplatin and radiation on DNA damage interaction, DNA repair, survival and radiosensitivity in NSCLCs. Initially, we characterized different NSCLC cell lines with respect to cisplatin/radiation sensitivity. To this end, we performed proliferation assays, cell cycle analysis, colony formation assays and analysis of CP-DNA adduct formation. We further hypothesized that the analysis of repair foci would provide important insights into the effect of cisplatin on activation of DSB repair. To address this question, we studied the dynamics of foci formation and its decay in these cells after exposure to CP and IR.
Initially, it was seen that CP significantly decreased the proliferation of all cell lines, despite having different IC50 values. Thus, cell lines were grouped into two groups with IC50 values 2 µM CP, which were called CP sensitive (H460, H661 and H522) and CP resistant (A549, H1299, H1975, H838, H23 and H520), respectively. Flow cytometry analysis showed that the majority of NSCLCs delayed in the G2/M phase of the cell cycle at 48 h after CP treatment, which mainly explains the effect on proliferation. Most importantly, analysis of colony formation showed that CP significantly enhanced the radiation sensitivity of only the CP sensitive cell lines (H460, H661, H522), but not in CP resistant cell lines (A549, H1299, H1975, H838, H23 and H520).
To analyze the molecular aspects of CP induced radiation sensitization, the effect on DSB repair was measured. It was seen that initial γH2AX foci formation significantly decreased in almost all cell lines after treatment with different concentrations of cisplatin. Similar effects were observed on the initial RAD51 foci formation. However, no significant differences were observed between less or more CP sensitive cell lines. In addition, we visualized intra-strand CP-GG adduct formation to characterize the molecular effect of cisplatin in NSCLCs and analyze its repair kinetics. The maximal level of CP-GG adduct formation was reached at about 12 h after CP washout and decreased thereafter, which was taken as a measure of adduct repair. However, no correlation between sensitivity to cisplatin and CP-GG crosslink formation was observed in the cell lines tested.
Furthermore, to further analyze the effect of damage interaction upon CP and IR treatment on the different repair pathways, the MRN complex, which has essential roles in detecting and repairing DSBs and activate DDR, was modulated. For this purpose, the small molecule Mirin, an inhibitor of MRE11 was used. To explain the potential mechanism of action, we studied the dynamics of foci formation and decay in these cells after cisplatin, Mirin and combined treatment schedules. Lastly, as a surrogate for non-transformed cells, we used HDFN and HDFA, and performed experiments similar to those performed with NSCLCs.
Interestingly, Mirin significantly enhanced the radiosensitivity to killing, especially in cell lines which were less sensitive to CP. However, combined treatment with Mirin and cisplatin significantly decreased the surviving fraction in all cell lines except H1975(R).
When the effect on overall DSB repair was examined in NSCLCs, it was seen that combined treatment with CP and Mirin significantly decreased the initial 53BP1 foci formation in less CP sensitive cell lines (A549, H1299, H838, H520 and H23), without an effect on cell lines which were more sensitive to cisplatin. These findings agree with colony assay results and thus supported the idea that inhibition of MRE11 with Mirin impairs overall repair and enhances the radio-sensitizing effect of cisplatin in cells resistant to CP. Furthermore, combined treatment also decreased the initial RAD51 foci formation in all cell lines except for H661. In addition, the data also show that Mirin significantly increases adduct formation in CP resistant cell lines (A549, H1299, H838, H520, H23), except for H1975, but not in the cell lines which were more sensitive to CP (H460, H661, H522).
Finally, HDFN and HDFA were used as a surrogate for non-transformed cells. Initially, the effects of cisplatin, Mirin and combined treatment on colony formation of plateau-phase or exponentially growing HDFN and HDFA cells were evaluated. Most importantly, Mirin and combined treatment showed no decrease in the surviving fraction but rather a slight increase. Interestingly, when we investigated the effect of CP and Mirin at the molecular level by foci scoring, we saw no significant changes in initial or residual γH2AX, 53BP1 and RAD51 foci formation. Lastly, CP adduct formation was significantly decreased by Mirin, which explains the slightly increased survival seen after Mirin treatment.
All in all, these data show that MRE11 has potential as a target to increase the sensitivity of tumor cells to combined therapies with CP and RT, without sensitizing non-transformed cells. However, further studies are required to evaluate the underpinning mechanisms in more detail.
Mit dieser vorliegenden Studie wurden die Auswirkungen von Cisplatin und einer kombinierten Behandlung auf die Schadensinteraktion, die DNA-Reparatur, das Überleben und die Radiosensitivität in nicht-kleinen Lungenkrebs-Zelllinien untersucht. Zunächst haben wir verschiedene NSCLC-Zelllinien im Hinblick auf Cisplatin/Strahlenempfindlichkeit charakterisiert. Zu diesem Zweck führten wir Proliferationsassays, Zellzyklusanalysen, Koloniebildungsassays und Analysen von CP-DNA-Adduktbildungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Cisplatin durch. Als Ersatz für nicht-transformierte Zellen wurden neonatale und adulte humane Dermalfibroblasten (HDFN, HDFA) verwendet und identische Experimente durchgeführt wie auch in den NSCLC-Zellen. Wir stellten ferner die Hypothese auf, dass die Analyse der Bildung von Reparaturfoci wichtige Einblicke in die Wirkung von Cisplatin auf die Aktivierung der DSB-Reparatursignalisierung (γH2AX, 53BP1 für NHEJ und RAD51 für HRR) liefern würde. Um diese Frage zu beantworten, untersuchten wir die Dynamik der Focibildung in diesen Zellen nach Bestrahlung mit IR.
Die Proliferation der Zelllinien H460, H661 und H522 wurde nach Behandlung mit CP im Vergleich zu A549, H1299, H1975, H838, H23 und H520 stärker verringert. Die Zellzyklusdaten zeigen, dass 48 h nach der CP-Behandlung die Mehrheit der NSCLCs in der eine Verzögerung in der G2/M-Phase Progression hatten. Die Analyse der Koloniebildungsdaten zeigte zudem, dass CP die Strahlenempfindlichkeit der Zelllinien H460, H661, H522, die im Proliferationsassay eine höhere Empfindlichkeit gegenüber CP zeigen, signifikant erhöhte. Im Vergleich dazu wurden in den Zelllinien A549, H1299, H1975, H838, H23 und H520, die weniger empfindlich auf CP reagierten keine signifikanten Veränderungen beobachtet. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse aus den Koloniebildungsassays war die Frage abzuleiten, ob diese Beobachtungen auf molekularer Ebene durch die Analyse der Reparaturwege erklärt werden könnten.
Die Daten zum Einfluss von CP auf die Bildung von strahleninduzierten Reparaturfoci bei NSCLCs, zeigen dass mit drei Konzentrationen von Cisplatin die anfängliche Bildung von γH2AX-Foci in fast allen Zelllinien signifikant abnahm. Ähnlich nahm auch die anfängliche Bildung von RAD51-Herden mit steigenden Konzentrationen von Cisplatin ebenfalls ab. Es wurden jedoch keine deutlichen Unterschiede zwischen den mehr oder weniger empfindlichen Zelllinien gegenüber der CP-Behandlung beobachtet. Wir beobachteten auch keine Korrelation zwischen der Empfindlichkeit gegenüber Cisplatin und der Bildung von CP-GG- IntrastangVernetzungen.
Um die Wechselwirkung der verschiedenen Reparaturwege nach CP und Bestrahlung weiter zu analysieren, betrachteten wir den MRE11/RAD50/NBS1 (MRN)-Komplex, der eine wesentliche Rolle bei der Erkennung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) und der Antwortreaktion auf DNA-Schäden (DNA damage response, DDR) spielt. Hierzu wurde Mirin, ein Inhibitor von MRE11eingesetzt. Anfänglich wurden Zellproliferationstests durchgeführt, um die geeignete Konzentration des Inhibitors zu identifizieren, gefolgt von Koloniebildungs- und CP-DNA-Adduktbildungsanalysen. Um einen möglichen Wirkmechanismus zu finden, wurde die Dynamik in der Entstehung und des Zerfalls von DNAReparatur-Foki in NSCLC-Zellen nach Cisplatin, Mirin und kombinierten Behandlungsplänen untersucht.
Die Daten zeigten, dass die Proliferation der Zelllinien H460, H661 und H522 durch CP im Vergleich zu A549, H1299, H1975, H838, H23 und H520 nach Behandlung mit Mirin verringert war. Zellzyklusanalysen zeigten den Grund für dieses Phänomen: Der Großteil der Zellpopulationen aller NSCLCs wies eine verlängerte G2/M-Phase des Zellzyklus auf, das wiederum einen verlangsamenden Effekt auf die Proliferation hat. Die CP-sensitiven Zelllinien H460, H661 und H522 zeigten eine erhöhte Sensitivität im Koloniebildungstest gegenüber Bestrahlung, wenn Sie vor der Bestrahlung mit CP behandelt wurden. Im Vergleich dazu wurden keine signifikanten Änderungen des Überlebens nach Behandlung mit Mirin in den Zelllinien A549, H1299, H1975, H838, H23 und H520 beobachtet, die gegenüber CP weniger empfindlich waren.
Unter Berücksichtigung der Ergebnisse aus Koloniebildungsassays fragten wir, ob diese Beobachtungen auf molekularer Ebene durch die Analyse der Reparaturwege erklärt werden könnten. Die Daten zeigen, daß Mirin die anfängliche Bildung von 53BP1-Foci als Maß für die Reparatursignalisierung durch NHEJ in den Zelllinien A549, H838 und H520 signifikant verringerte. Darüber hinaus führte die kombinierte Behandlung mit Mirin und CP zu einer signifikanten Reduktion der 53BP1-Fokibildung in den Zelllinien A549, H1299, H838, H520 und H23. Es wurden jedoch keine signifikanten Veränderungen in den Zelllinien beobachtet, die gegenüber Cisplatin empfindlicher waren. Diese Ergebnisse zeigten eine konsistente Korrelation mit den Überlebensdaten im Kolonie-Assay und stützten somit die Idee, dass die Hemmung von MRE11 mit Mirin den NHEJ-Reparatursignalweg beeinträchtigt und die strahlensensibilisierende Wirkung von Cisplatin in Zellen verstärkt, die weniger empfindlich auf CP reagieren. Darüber hinaus verringerte die kombinierte Behandlung auch die anfänglichen RAD51-Foci-Bildungen signifikant in allen diesen Zelllinien mit Ausnahme von H661. Schließlich wurde die Wirkung von Mirin auf die CP-Adduktbildung in diesen Zelllinien untersucht, um die bisherigen Ergebnisse weiter zu erklären. Es zeigte sich, dass die Behandlung mit Mirin die Adduktbildung in resistenteren Zelllinien (A549, H1299, H838, H520, H23) signifikant erhöhte, mit Ausnahme von H1975, aber nicht in den Zelllinien, die empfindlicher auf CP reagierten (H460, H661, H522, H1975).Schließlich wurden die Untersuchungen auf neonatale (HDFN) und adulte (HDFA) menschliche dermale Fibroblasten ausgeweitet um den Effekt von CP in Kombination mit Strahlung und Mirin in Bormalgewebszellen zu untersuchen. Zunächst wurde die Wirkung von Cisplatin, Mirin und einer kombinierten Behandlung auf die Koloniebildung von in plateau- oder exponentiell wachsenden HDFN- und HDFA-Zellen bewertet. Mirin und die kombinierte Behandlung hatte keine signifikante Reduktion der Überlebensfraktion zur Folge. Im Gegensatzt wurde eher eine leichte Zunahme der Überlebensfraktion beobachtet. Darüber hinaus war die Zellzyklusprogression der Fibroblasten nach CP und kombinierter Behandlung eher in der SPhase verzögert, während die NSCLCs hauptsächlich in der G2/M-Phase arretiert wurden. Interessanterweise haben wir bei der Untersuchung der Wirkung von CP und Mirin auf molekularer Ebene durch Foci-Scoring keine signifikanten Veränderungen in der initialen oder verbleibenden γH2AX-, 53BP1- und RAD51-Foci-Bildung festgestellt. Schließlich wurden nach der Behandlung mit Mirin die Adduktbildungen verringert, so dass die Zellen vor höheren Adduktspiegeln geschützt wurden.
Insgesamt zeigen diese Daten, dass MRE11 Inhibition in Kombination und CP in Kombination mit Bestrahlung das Potenzial hat gezielt CP resistente Tumorzellen zu sensitivieren und Normalzellen zu schonen um das therapeutische Fenster zu vergrößern. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die beobachteten Effekte genauer zu bewerten.