Characterizing DNA Origami Linear Assemblies
Head and neck carcinomas (HNC) are often associated with dysbiosis and bacterial superinfection, high frequency of neutrophils in the tissue and increased metastasis. All these factors are associated with poor prognosis of patients. This study has functionally interconnected those three important factors and explored potential mechanism of actions. To achieve this goal we designed an in vitro system that mimics the cross-talk of tumor cells and neutrophils in the presence of bacterial stimulation. We found that such a stimulation enhanced the generation of an invasive and metastatic tumor cell phenotype via the neutrophil activation. Metastatic tumor cells displayed strong mesenchymal phenotype, pro-metastatic gene signature and enhanced migratory and metastatic abilities. Morphological changes of tumor cells were directly induced by bacterial compounds, while functional modulation of cancer cells were indirectly induced by secretion of NE and MMP-9 from activated PMN. The main elucidated metastatic mechanism was the resistance of tumor cells to NK cells cytotoxicity, which led to the immune escape of tumor cells. This resistance was an effect of NETs forming a protective shield around the tumor cells. The bacterial modulation turned out not to be limited to tumor cells, as we also found that activation of stromal cells also promoted changes in the neighboring cancer cells. Our data suggests that bacteria modulate the cross-talk of tumor cells/stromal cells and PMN thereby enhancing the tumor progression and metastasis via promoting innate immune escape mechanism.
This thesis describes the linear assembly of a 24-helix bundle DNA origami structure displaying two interfaces, A and B, that are perfectly shape-complementary and partially self-complementary. The aim was to explore the effects of two distinct association mechanisms, hybridization and stacking, on the polymerization of the structure, as well as the influence of interface symmetries on the kinetic and thermal properties of the assemblies. The base stacking-driven isologous dimerization process and the impact of one base pair gapped helices on interface associations were also investigated1. To achieve a more dynamic polymerization behavior, the output of an autocatalytic DNA reaction network was used to fuel the polymerization process, with finetuning and reversibility also being achieved.
The dimers presented 8 or 16 helices with a one base pair gap. Higher numbers of gapped helices adversely affected thermal assemblies while contributing significantly to thermal stability upon heating. A threshold of at least 8 (or 33 %) activated helices was found to be necessary for the successful stacking of the monomer subunits, with a resulting stacking energy threshold of ‑7.35 kcal/mol. Stacking forces were successfully correlated to sequence-specific stacking energies. Increasing the extent of gapped helices to 67 % (instead of 33 %) led to a two-fold increase in the initial dimerization rate (kain = 0.14 min‑1 for AA‑ and 0.3 min-1 for BB‑stacking, respectively), and effectively halved the stacking time.
The equilibrium distribution followed the degree of shape-complementarity for all types of random stacking associations: namely AB, AA, and BB. While kinetic assemblies were favored for BB‑stacking, filament depletion could also be observed shortly after assembly. Critical concentrations of hybridization vs. stacking were in the picomolar range, with hybridization ccrit temperature-dependent and stacking temperature independent. Stacking-based polymers initially elongated ten-fold faster than hybridization-based species, especially in the first hour. Hybridization initially had a more flexible connection with necessary strand displacements, while both mechanisms grew from monomers and oligomers. However, only stacking could integrate new components into equilibrium filaments through scission. Overall, the thermal stability of hybridization polymer connections was two °C higher than for stacking obtained polymers. Arranging the placements of hybridized helices could finetune polymerization with only outer helices outperforming complete activation.
Lastly, the dynamic behavior of an adapted autocatalytic DNA reaction network was successfully integrated into the DNA origami hybridization polymerization by introducing and optimizing an integrated interface binding identical fuel strands. Coupling the DRN's gradual release of the fuel strand to the polymerization was limiting mainly by the decreased total strand release but surprisingly not notably in the reaction kinetics. Introducing a five-base toehold domain in the fuel strand allowed for finely tuning the polymerization kinetics to reverse the reaction altogether.
Im Zuge dieser Dissertation wurden die linearen Verbünde des 24-Helix DNA Origamis mit je einem A- und einem B-Ende, welche perfekt formkomplementär und partiell homokomplementär zueinander sind, untersucht. Ziel war der Vergleich der Polymerisationsmechanismen Hybridisierung und Basenstapelung, sowie die Charakterisierung des Einflusses von Grenzflächensymmetrien auf die kinetischen und thermodynamischen Eigenschaften. Außerdem wurden die Auswirkungen von Basenpaarlücken auf die auf Basenstapelkräften basierende isologe Dimerisierung betrachtet1. Um ein dynamischeres Polymerisationsverhalten zu erreichen, wurde der Output eines autokatalytischen DNA-Reaktionsnetzwerks als Treibstoff verwendet. Darüber hinaus wurde eine Feinabstimmung und Reversibilität realisiert.
Die Dimere wiesen je acht oder 16 Helices mit einer Lücke von einem BP auf. Eine höhere Anzahl an Lücken wirkte sich zwar nachteilig auf die thermische Assemblierung aus, trug jedoch erheblich zur thermischen Stabilität bei. Es wurde ein Stacking-Schwellenwert von mindestens acht (33 %) aktivierten Helices für die Monomereinheiten ermittelt, welcher einer Energie von ‑7,35 kcal/Mol entsprach. Die Stapelungsstärke wurde erfolgreich mit den sequenzspezifischen Stapelenergien korreliert. 67 % (BB) anstelle von 33 % (AA) unvollkommenen Helices erhöhten die anfängliche Dimerisierungsrate um den Faktor zwei (kain = 0.14 min‑1 für AA und 0.3 min-1 für BB) und halbierten die effektive Assoziationszeit.
Der Grad der Komplementarität aller Assoziationstypen AB, AA und BB bestimmte die Gleichgewichtsverteilung der zufälligen Basenstapelung. Während die kinetische Assoziation der BB-Stapelung bevorzugt wurde, konnte nach Kurzem ein Schrumpfen des Filaments beobachtet werden. Die kritischen Konzentrationen der Hybridisierung und Stapelung lagen im pikomolaren Bereich, wobei die Hybridisierung temperaturabhängig und die Stapelung temperaturunabhängig war. Polymere auf Stapelbasis wuchsen zu Anfang zehnmal schneller als Hybridisierungspolymere, insbesondere in der ersten Stunde. Die Hybridisierung zeigte anfangs flexiblere Verbindungen, wohl durch notwendige Strangablösungen, während beide Mechanismen Polymere aus Monomeren und auch Oligomeren bilden konnten. Allerdings konnte nur die Stapelung neue Monomere durch Spaltung oder Eingliederung in bestehende Filamente integrieren. Insgesamt war die thermische Stabilität der Hybridisierungspolymerverbindungen um zwei °C höher als die der durch Stapeln entstandenen Polymere. Die gezielte Aktivierung der zu hybridisierenden Helices ermöglichte eine Feinabstimmung der Polymerisation, wobei die alleinige Aktivierung der äußeren Helices kinetisch die der vollständigen Aktivierung übertraf.
Schließlich wurde das dynamische Verhalten eines adaptierten autokatalytischen DNA-Reaktionsnetzwerks erfolgreich in die DNA-Origami-Hybridisierungs-Polymerisation integriert, indem eine Bindestelle für identische fuel-Stränge an den Monomer-Enden eingeführt und optimiert wurde. Die Kopplung des allmählich freigesetzten fuel-Strangs an die Polymerisation hatte hauptsächlich Auswirkungen durch die verringerte Gesamtstrangfreisetzung, aber nicht wesentlich auf die Reaktionskinetik. Die Erweiterung des fuel-Strangs um eine Toehold-Domäne, ermöglichte eine Feinabstimmung der Polymerisationskinetik sowie die vollständige Reaktionsumkehr.