Fluctuations of alternative end-joining throughout the cell cycle with emphasis in Mitosis

Pollakis, Gerasimos

doi:10.17185/duepublico/78696

DissertationAll rights reservedWed Jul 24 2024Published

Fluctuations of alternative end-joining throughout the cell cycle with emphasis in Mitosis

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Durch ionisierende Strahlung (IR) induzierte DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) in Zellen höherer Eukaryoten werden hauptsächlich durch die Reparaturmechanismen der konstitutiven nichthomologen Endverknüpfung (c-NHEJ) und der homologen Rekombination (HR) repariert. Wenn diese Wege beeinträchtigt werden, können Zellen eine weitere Form der Endverknüpfung, den sogenannten alternativen Endverknüpfungs-Reparaturweg (alt-EJ) verwenden, die als „Backup“ fungiert. Darüber hinaus kann unter bestimmten Bedingungen und für bestimmte Regionen des Genoms auch die Einzelstrang-Annealing (SSA) eingreifen. Während die c-NHEJ im gesamten Zellzyklus aktiv ist, is die HR nur in der S- und G2-Phase des Zellzyklus aktiv. Die Alt-EJ und die SSA können während des gesamten Zellzyklus aktiv sein, weisen aber ihre höchste Aktivität in der G2-Phase auf. Die Effizienz von alt-EJ während der frühen/mittleren S-Phase bleibt weiterhin ungeklärt. Insbesondere deuten mehrere Berichte in der Literatur darauf hin, dass alle Mechanismen der DSB-Reparatur während der Mitose (M-Phase) unterdrückt werden. Diese Berichte stehen im Gegensatz zu früheren Studien aus unserem Labor, aber auch zu Studien von anderen Forschern, die eine effektive Reparatur von DSB in M-Phasen-Zellen zeigen konnten.

Die aktuelle Studie zielt darauf ab, zwei Schlüsselfragen zu beantworten: Wie verändert sich die Effizienz von alt-EJ von der frühen bis zur mittleren S-Phase und G2-Phase des Zellzyklus, und wie ist die tatsächliche Effizienz der DSB Reparatur in der M-Phase von Säugertierzellen. Insbesondere, welche DSB Reparaturmechanismen sind daran beteiligt?

Zur Klärung dieser Fragestellungen wurden Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE)-Experimente in synchronisierten A549-Zellen in der frühen S-Phase durchgeführt. Hierfür wurden die Zellen mit 20 Gy Röntgenstrahlen bestrahlt und die Kinetik der DSB-Reparatur bis zu 4 Stunden nach der Bestrahlung analysiert. Um die Genauigkeit der PFGE-Analyse zu verbessern, wurde eine neue mathematische Methode der PFGE-Analyse entwickelt, welche Schwankungen der Sensitivität der PFGE, insbesondere in replizierenden Zellen, berücksichtigt. Unter Verwendung dieser Methode in synchronisierten Zellen in der frühen S-Phase und bei Unterdrückung des c-NHEJ wurde festgestellt, dass die Menge an DSB 4 Stunden nach der Bestrahlung um fast 80 % reduziert wurde, ähnlich wie bei bei synchronisierten Zellen in der G2-Phase. Daher folgt, dass Zellen die Fähigkeit besitzen strahleninduzierte DSB während der S- und G2-Phasen mit der gleichen Effizienz mit altEJ zu reparieren, wenn der c-NHEJ unterdrückt ist. Bei RPE- und A549-Zellen, die durch Schütteln (shake-off) in der M-Phase synchronisiert werden, ist die Funktionalität von alt-EJ stark eingeschränkt.Wird die Funktion der c-NHEJ mit einem DNA-PKcs-Inhibitor unterdrück, werden DSB in mitotischen Zellen 4 Stunden nach der Bestrahlung mit 20 Gy nur um ~30 % reduziert. Diese Ergebnisse und unsere früheren Studien lassen darauf schließen, dass alt-EJ in G0 unterdrückt wird. Wenn Zellen in die G1-Phase eintreten, erholt sich die Funktionalität von alt-EJ und erreicht ihre maximale Effizienz, wenn sie durch S und G2 gehen und fällt wieder ab, wenn die Zellen in die Mitose eintreten.

In Bezug auf die Fähigkeit von Säugertierzellen, DSB in der M-Phase zu reparieren, konnte gezeigt werden, dass im Gegensatz zu den jüngsten Berichten in der Literatur, eine robuste Reparatur von DSB während der M-Phase messbar ist. In voller Übereinstimmung mit der Literatur wurde unter Verwendung von Durchflusszytometrie und Foci-Analysengefunden festgestellt, dass die Werte von γ-H2AX mit der Zeit nicht abnehmen, wenn Zellen in der Metaphase angehalten werden. Wenn jedoch die Reparatur von DSB in denselben Zellpopulationen mit PFGE gemessen wurde, konnte sehr wohl eine robuste Reparatur von DSB innerhalb von 4 Stunden nach Bestrahlung (10– 30 Gy), je nach Zelllinie, festgestellt werden. Darüber hinaus unterstützen PCC-Experimente, die die Chromosomenbrüche in der G1-Phase analysieren, die Vorstellung, dass Zellen DSB reparieren, wenn sie für längere Zeit in der Metaphase angehalten werden. Dies zeigt sich daran, dass die Zellen mit weniger nicht reparierten Chromosomenbrüchen in die G1 Phase eintreten, abhängig davon, wie lange diese Zellen in der Metaphase angehalten wurden. Auch nimmt die Anzahl der nicht reparierten PCC-Brüche proportional mit der Zeit in der Metaphase ab. Ein weiterer Befund, der die DSB-Prozessierung in der Metaphase bestätigt, ist der Nachweis isodizentrischer Chromosomen nach Bestrahlung mitotischer Zellen. Die Analyse der DSBProzessierung in der Metaphase unter Verwendung von PFGE ergab, dass diese Prozessierung hauptsächlich die Funktion von c-NHEJ widerspiegelt, da sie durch Inhibitoren von DNA-PKcs stark unterdrückt werden kann. Bemerkenswerterweise ist die unter diesen Bedingungen gemessene residuale Endverknüpfung empfindlich gegenüber Defekten in Komponenten von altEJ, wie etwa PARP1 und den Ligasen I/III. Die Hemmung von RAD52 oder ATR hatte keinen Einfluss auf die Reparaturkinetik von mitotischen DSBs. Diese Ergebnisse zeigen, dass SSA und HR bei der mitotischen DSB-Reparatur keine Rolle spielen. Die aktuelle Studie in Kombination mit unseren früheren Berichten zeigt, dass alt-EJ in G0 eine geringe Aktivität aufweist, die ansteigt, wenn die Zellen in die G1-Phase übergehen, und während der S/G2-Phase des Zellzyklus maximiert wird; um dann abrupt abzufallen, wenn die Zellen in die Mitose eintreten, obwohl sie immer aktiv bleibt. Darüber hinaus belegen diese Ergebnisse eine effiziente Reparatur von DSB während der Mitose hauptsächlich durch c-NHEJ und sekundär durch alt-EJ. Obwohl die DSB- Signalübertragung in Interphase-Zellen die Reparaturaktivität sehr gut widerspiegelt, zeigt schließlich die Kinetik von Schlüsselproteinen, die mit der Reparatur in Verbindung stehen, wie z.B. γ-H2AX, während der M-Phase des Zellzyklus diese Reparatur nicht.

DNA double strand breaks (DSBs) induced by ionizing radiation (IR) in cells of higher eukaryotes are repaired mainly by classical non-homologous end-joining (c-NHEJ) and homologous recombination (HR). When these pathways are compromised, cells may use another form of endjoining that operates as a backup, the so-called alternative end-joining (alt-EJ) repair pathway. In addition, single strand annealing (SSA) may also engage under certain conditions and for certain regions in the genome. While c-NHEJ is active throughout the cell cycle, HR functions only in Sand G2-phase of the cell cycle. Alt-EJ and SSA may function throughout the cell cycle, but they are more active in G2-phase. The efficiency of alt-EJ during early/mid S-phase remains unclear. Notably, several reports in literature suggest that all forms of DSB processing are suppressed during M-Phase. These reports are in contrast to earlier studies from our laboratory, but also to studies of other investigators, showing efficient repair of DSBs in M-phase cells.

The current study aims to address two key questions: How does the efficiency of alt-EJ fluctuate from early/mid S-phase up to G2-phase of the cell cycle, and what is the actual ability of mammalian M-phase cells to repair DSBs and which repair pathways are involved?

Pulse field gel electrophoresis (PFGE) experiments were carried οn highly synchronized A549 cells in early S-phase. Cells were exposed to 20Gy of X-rays and DSB repair kinetics were analyzed up to 4h post irradiation. In order to improve the accuracy of PFGE analysis, a new mathematical analysis method was developed, which takes into consideration the sensitivity changes of PFGE, as cells replicate their DNA. Using this method of PFGE analysis in synchronized early S-phase cells and upon suppression of c-NHEJ, the amount of DSBs was found to be reduced by almost 80% 4h after irradiation, similar to G2 synchronized cells. Hence, upon suppression of c-NHEJ, cells have the ability to repair DSBs with the same efficiency during Sand G2-phase through alt-EJ. RPE and A549 cells, which are synchronized in M-phase by shakeoff, experience seriously reduced alt-EJ functionality. Upon suppression of c-NHEJ using a DNAPKcs inhibitor, mitotic cells reduced their DSBs by only ~30% 4h after exposure to 20Gy. Our previous studies have found compromised alt-EJ in G0 cells as well as limited efficiency in G1 cells. These findings, combined with the current results, lead to the following conclusion: alt-EJ is suppressed in G0, the functionality of alt-EJ recovers when cells enter G1-phase and reaches its maximum efficiency as they progress through S- and G2-phase, dropping abruptly again as cells enter mitosis.

Regarding the ability of M-phase mammalian cells to repair DSBs, and in contrast to recent reports in the literature, the current study reveals a robust repair of DSBs during M-phase. In full agreement with the literature, the use of flow cytometry and foci detection shows that the levels of γ-H2AX are not decreasing with time when cells are blocked at metaphase. When, however, repair of DSBs was measured in the same cell populations using PFGE, a robust repair of DSBs was evident within 4h after IR (10-30Gy) depending on the cell line. Moreover, PCC experiments analyzing chromosome breaks in G1-phase support the notion that, when cells are blocked in metaphase for increasing periods of time, they repair DSBs. It was specifically observed that the cells arrive in G1 with less unrepaired chromosome breaks depending on the time of arrestment in metaphase. In other words, the number of unrepaired PCC breaks is inversely proportional to the time, during which the cells are blocked in metaphase. Another finding, which confirms DSB processing during metaphase after irradiation of mitotic cells, is that Isodicentric chromosomes were detected. Analysis of DSB processing in metaphase using PFGE revealed that this processing mainly reflects the function of c-NHEJ, as the DSB repair can be strongly suppressed by inhibitors of DNA-PKcs. Strikingly, residual rejoining measured under these conditions is sensitive to defects in components of alt-EJ, such as PARP1 and Ligases I/III. Inhibition of RAD52 and ATR had no effect on the repair kinetics of mitotic DSBs. These results indicate that SSA and HR play no role in mitotic DSB repair.

The current study, combined with our previous reports, leads to the conclusion that alt-EJ has low activity in G0, which rises as cells proceed to G1-phase and maximizes during the S/G2-phase of the cell cycle, only to drop abruptly when cells enter mitosis, although it still remains active. Additionally, the results show efficient repair of DSBs in mitosis mainly through c-NHEJ and secondarily through alt-EJ. Finally, although in interphase cells DSB signaling reflects the repair activity very well, during M-phase of the cell cycle the kinetics of key proteins related to the repair, i.e. γ-H2AX, fail to reflect this repair.

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