Durch ionisierende Strahlung (IR) induzierte DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) in Zellen höherer Eukaryoten werden hauptsächlich durch die Reparaturmechanismen der konstitutiven nichthomologen Endverknüpfung (c-NHEJ) und der homologen Rekombination (HR) repariert. Wenn diese Wege beeinträchtigt werden, können Zellen eine weitere Form der Endverknüpfung, den sogenannten alternativen Endverknüpfungs-Reparaturweg (alt-EJ) verwenden, die als „Backup“ fungiert. Darüber hinaus kann unter bestimmten Bedingungen und für bestimmte Regionen des Genoms auch die Einzelstrang-Annealing (SSA) eingreifen. Während die c-NHEJ im gesamten Zellzyklus aktiv ist, is die HR nur in der S- und G2-Phase des Zellzyklus aktiv. Die Alt-EJ und die SSA können während des gesamten Zellzyklus aktiv sein, weisen aber ihre höchste Aktivität in der G2-Phase auf. Die Effizienz von alt-EJ während der frühen/mittleren S-Phase bleibt weiterhin ungeklärt. Insbesondere deuten mehrere Berichte in der Literatur darauf hin, dass alle Mechanismen der DSB-Reparatur während der Mitose (M-Phase) unterdrückt werden. Diese Berichte stehen im Gegensatz zu früheren Studien aus unserem Labor, aber auch zu Studien von anderen Forschern, die eine effektive Reparatur von DSB in M-Phasen-Zellen zeigen konnten.

 

Die aktuelle Studie zielt darauf ab, zwei Schlüsselfragen zu beantworten: Wie verändert sich die Effizienz von alt-EJ von der frühen bis zur mittleren S-Phase und G2-Phase des Zellzyklus, und wie ist die tatsächliche Effizienz der DSB Reparatur in der M-Phase von Säugertierzellen. Insbesondere, welche DSB Reparaturmechanismen sind daran beteiligt?

 

Zur Klärung dieser Fragestellungen wurden Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE)-Experimente in synchronisierten A549-Zellen in der frühen S-Phase durchgeführt. Hierfür wurden die Zellen mit 20 Gy Röntgenstrahlen bestrahlt und die Kinetik der DSB-Reparatur bis zu 4 Stunden nach der Bestrahlung analysiert. Um die Genauigkeit der PFGE-Analyse zu verbessern, wurde eine neue mathematische Methode der PFGE-Analyse entwickelt, welche Schwankungen der Sensitivität der PFGE, insbesondere in replizierenden Zellen, berücksichtigt. Unter Verwendung dieser Methode in synchronisierten Zellen in der frühen S-Phase und bei Unterdrückung des c-NHEJ wurde festgestellt, dass die Menge an DSB 4 Stunden nach der Bestrahlung um fast 80 % reduziert wurde, ähnlich wie bei bei synchronisierten Zellen in der G2-Phase. Daher folgt, dass Zellen die Fähigkeit besitzen strahleninduzierte DSB während der S- und G2-Phasen mit der gleichen Effizienz mit altEJ zu reparieren, wenn der c-NHEJ unterdrückt ist. Bei RPE- und A549-Zellen, die durch Schütteln (shake-off) in der M-Phase synchronisiert werden, ist die Funktionalität von alt-EJ stark eingeschränkt.Wird die Funktion der c-NHEJ mit einem DNA-PKcs-Inhibitor unterdrück, werden DSB in mitotischen Zellen 4 Stunden nach der Bestrahlung mit 20 Gy nur um ~30 % reduziert. Diese Ergebnisse und unsere früheren Studien lassen darauf schließen, dass alt-EJ in G0 unterdrückt wird. Wenn Zellen in die G1-Phase eintreten, erholt sich die Funktionalität von alt-EJ und erreicht ihre maximale Effizienz, wenn sie durch S und G2 gehen und fällt wieder ab, wenn die Zellen in die Mitose eintreten.

 

In Bezug auf die Fähigkeit von Säugertierzellen, DSB in der M-Phase zu reparieren, konnte gezeigt werden, dass im Gegensatz zu den jüngsten Berichten in der Literatur, eine robuste Reparatur von DSB während der M-Phase messbar ist. In voller Übereinstimmung mit der Literatur wurde unter Verwendung von Durchflusszytometrie und Foci-Analysengefunden festgestellt, dass die Werte von γ-H2AX mit der Zeit nicht abnehmen, wenn Zellen in der Metaphase angehalten werden. Wenn jedoch die Reparatur von DSB in denselben Zellpopulationen mit PFGE gemessen wurde, konnte sehr wohl eine robuste Reparatur von DSB innerhalb von 4 Stunden nach Bestrahlung (10– 30 Gy), je nach Zelllinie, festgestellt werden. Darüber hinaus unterstützen PCC-Experimente, die die Chromosomenbrüche in der G1-Phase analysieren, die Vorstellung, dass Zellen DSB reparieren, wenn sie für längere Zeit in der Metaphase angehalten werden. Dies zeigt sich daran, dass die Zellen mit weniger nicht reparierten Chromosomenbrüchen in die G1 Phase eintreten, abhängig davon, wie lange diese Zellen in der Metaphase angehalten wurden. Auch nimmt die Anzahl der nicht reparierten PCC-Brüche proportional mit der Zeit in der Metaphase ab. Ein weiterer Befund, der die DSB-Prozessierung in der Metaphase bestätigt, ist der Nachweis isodizentrischer Chromosomen nach Bestrahlung mitotischer Zellen. Die Analyse der DSBProzessierung in der Metaphase unter Verwendung von PFGE ergab, dass diese Prozessierung hauptsächlich die Funktion von c-NHEJ widerspiegelt, da sie durch Inhibitoren von DNA-PKcs stark unterdrückt werden kann. Bemerkenswerterweise ist die unter diesen Bedingungen gemessene residuale Endverknüpfung empfindlich gegenüber Defekten in Komponenten von altEJ, wie etwa PARP1 und den Ligasen I/III. Die Hemmung von RAD52 oder ATR hatte keinen Einfluss auf die Reparaturkinetik von mitotischen DSBs. Diese Ergebnisse zeigen, dass SSA und HR bei der mitotischen DSB-Reparatur keine Rolle spielen. Die aktuelle Studie in Kombination mit unseren früheren Berichten zeigt, dass alt-EJ in G0 eine geringe Aktivität aufweist, die ansteigt, wenn die Zellen in die G1-Phase übergehen, und während der S/G2-Phase des Zellzyklus maximiert wird; um dann abrupt abzufallen, wenn die Zellen in die Mitose eintreten, obwohl sie immer aktiv bleibt. Darüber hinaus belegen diese Ergebnisse eine effiziente Reparatur von DSB während der Mitose hauptsächlich durch c-NHEJ und sekundär durch alt-EJ. Obwohl die DSB- Signalübertragung in Interphase-Zellen die Reparaturaktivität sehr gut widerspiegelt, zeigt schließlich die Kinetik von Schlüsselproteinen, die mit der Reparatur in Verbindung stehen, wie z.B. γ-H2AX, während der M-Phase des Zellzyklus diese Reparatur nicht.