Polyphosphate metabolism and profiling of myristoylation in Sulfolobus acidocaldarius

Archaea were introduced as the third domain of life in the late 1970s. Nevertheless, both chapters of this thesis illustrate that essential metabolic pathways and cellular processes are still not fully understood. An important feature of the archaeal domain is the great variance of organisms, containing some members which are able to adapt to diverse extreme habitats. Previous studies already demonstrated the function of polyP in Archaea, acting in a variety of stress responses and thus helping the cell to adapt to new environmental conditions. Likewise, this polymer was described to provide energy through high-energy phosphoanhydride bonds, as well as having many other functions such as phosphate storage, influence on motility, biofilm formation and copper tolerance in Archaea. With respect to polyP metabolism studied in chapter 3.1, it has been determined for Archaea by bioinformatic analysis that many of these organisms do not comprise a complete metabolic pathway. This includes the Crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius, where no enzyme responsible for polyP synthesis could be ascertained. However, the presence of polyP, as well as the presence of an exopolyphosphatase (PPX), the enzyme responsible for polyP hydrolysis, have been demonstrated in this organism. Accordingly, PPX was biochemically characterized and showed high specific activity, favoring long-chain polyP (P700) degradation. Using 31P NMR analysis, enzymatic degradation of polyP45 was demonstrated, yielding the enzymatically catalyzed formation of orthophosphate and the heat-stable by-product cyclic-P3 (non-enzymatically). In the search for the polyphosphate kinase, the examination of the genome organization revealed two thymidylate kinase (dTMPK) genes (saci_2019, saci_2020) in the gene neighborhood of the ppx gene, with dTMPKs sharing high structural similarity to PPK2 enzymes. Moreover, a third dtmpk gene (saci_0893) was examined, which is differently located in the genome and is the only one of the three dTMPKs comprising dTMPK function. Moreover, Saci_2019 was demonstrated to function as PPK, with Saci_2020 stimulating PPK activity, resulting in an increased specific activity for the heteromeric enzyme. Heteromeric PPK catalyzed polyP formation directly from ATP without the use of a precursor, meanwhile ADP inhibition and a clear preference for ATP as a substrate were observed. Consistent with PPK2 features, the enzyme also catalyzed the reverse reaction and showed a clear preference in the polyP-dependent nucleotide-forming direction (ATP over GTP). In addition, the reaction equilibrium could be influenced in favor of polyP synthesis by circumventing ADP inhibition using an ATP recycling system, thus allowing detection of polyP formation by 31P NMR. In summary, the first chapter of this thesis presents the discovery of the first crenarchaeal PPK, which we describe as a dTMPK-like heteromeric PPK. The second part of this thesis addresses the study of myristoylation in S. acidocaldarius. To date, myristoylation has been predominantly studied in Eukaryotes. Focusing on Archaea, the myristoylation has rarely been studied in this domain and has only been reported for some members of the Euryarchaeota. However, some arguments are present suggesting that myristoylation plays a role in Archaea, although FAs are not part of their membrane lipids. For instance, some archaeal organisms are able to utilize FAs and the presence of FA metabolism has also been demonstrated in S. acidocaldarius. Furthermore, a NAD+ -dependent deacetylase (Sir2) was described to deacetylate Alba in vitro. This class of enzymes was also reported to catalyze the cleavage of long-chain acyl-modifications, including myristoylation. Since S. acidocaldarius also exhibits a Sir2 homolog and has been shown to synthesize and degrade FAs, this organism was used to study myristoylation of proteins. To identify the target proteins a bioorthogonal labeling method using a myristic acid alkyne probe was performed. Through cellular processes, the corresponding proteins were labeled in vivo and after subsequent cell disruption, the probe could be bound to a fluorophore using copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). In-gel visualization illustrated the results of this method and enabled direct comparison with the negative control. On a larger scale, cell lysates were clicked with a biotin tag and subsequently enriched via an avidin pulldown. These samples were further used for LC-MS/MS analysis, thus identifying the labeled proteins. Three top hits Saci_1322, Saci_1188 and Saci_1114 were identified by the overlap of four biological replicates. Saci_1322 is a homolog of the studied Alba protein from S. solfataricus, whereas Saci_1114 has previously been identified to be a -ketothiolase involved in FA metabolism. Considering classification of all labeled proteins obtained the predicted functions were related to metabolism and genetic information processing. According to the representation by the three candidates, most proteins are involved in lipid transport and metabolism as well as energy production and conversion. Moreover, the myristoylome data resembles archaeal N-lysine acetylome data, which leads to the suggestion that lysine myristoylation may be present in Archaea and thus comprises a regulatory function of metabolic and cellular processes. In order to conclude concrete statements about these properties, further analyses would have to follow up on these initial experiments, in which, for example, enzymatic myristoylation will be confirmed in vitro. For this, the potential target proteins identified here may be used. In summary, the first archaeal myristoylome data was described providing some initial insights in the presence and function of protein myristoylation in S. acidocaldarius.

Archaeen wurden in den späten 1970er Jahren als dritte Domäne des Lebens eingeführt. Dennoch veranschaulichen beide Kapitel dieser Arbeit, dass bis heute wesentliche Stoffwechselwege und zelluläre Prozesse von Archaeen noch nicht aufgeklärt sind. Ein wesentlicher Aspekt ist dabei auch die große Varianz der Organismen innerhalb dieser Domäne, die in der Lage sind, sich unterschiedlichsten extremen Lebensräumen anzupassen. In einigen Arbeiten wurde bereits die Funktion von Polyphosphaten (PolyP) demonstriert, die als Reaktion auf eine Vielzahl von Stressfaktoren synthetisiert oder abgebaut werden und so der Zelle helfen, sich an neue Umweltbedingungen anzupassen. Ebenfalls werden diesem Polymer aber auch die Bereitstellung von Energie durch die hoch-energetische Phosphoanhydrid-Bindung zugesprochen, sowie viele weitere Funktionen, wie Phosphatspeicherung, Einfluss auf Zellmotilität, Biofilmbildung und Kupferresistenz. In Bezug auf den PolyP-Metabolismus, der in Kapitel 3.1 untersucht wurde, ist für Archaeen durch bioinformatische Analysen festgestellt worden, dass viele archaelle Organismen keinen vollständigen Stoffwechselweg aufweisen. Dazu gehört auch das Crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius, dem das Enzym fehlt, welches verantwortlich für die PolyP-Synthese ist. In den bisher verfügbaren Forschungsstudien wurde die Anwesenheit des Polymers in S. acidocaldarius demonstriert, sowie die Anwesenheit der Exopolyphosphatase (PPX), des Enzyms, welches für die PolyP-Hydrolyse verantwortlich ist. Darauf aufbauend wurde die PPX biochemisch charakterisiert und zeigte eine hohe spezifische Aktivität, wobei langkettige polyP (P700) favorisiert umgesetzt wurden. Mithilfe von 31P-NMR Messungen konnte der enzymatische Abbau von PolyP45 gezeigt werden, wobei das hitzestabile Nebenprodukt Trimetaphosphat (cP3) entstanden ist. Durch Anwesenheit von Kalium- oder Magnesium-Ionen wird diese Zyklisierung bei hohen Temperaturen begünstigt, sodass dieses Nebenprodukt neben dem enzymatisch freigesetzten Phosphat (Pi) gebildet wurde. Bei der Suche nach der Polyphosphatkinase (PPK) wurde zuerst die Genomorganisation näher angeschaut. Neben dem ppx Gen wurden zwei Thymidylatkinase (dTMPK)-Gene (saci_2019 und saci_2020) identifiziert. Da dTMPKs für ihre strukturelle Ähnlichkeit zu den PPKs der Familie 2 bekannt sind, wurden diese zunächst auf ihre enzymatische Funktion untersucht, darin eingeschlossen eine dTMPK, dessen Gen an anderer Stelle im Genom lokalisiert ist (saci_0893). Dabei wurde die dTMPK-Funktion von Saci_0893 nachgewiesen, sowie die PPK-Funktion der übrigen annotierten dTMPKs (Saci_2019 und Saci_2020). Genauere Untersuchungen ergaben, dass Saci_2019 die aktive Untereinheit darstellte, aber Saci_2020 die PPK-Aktivität von Saci_2019 stimulierte, sodass das heteromere Enzym eine deutlich höhere spezifische Aktivität zeigte. Entsprechend der Eigenschaft einer PPK der Familie 2 zeigte das Enzym eine Präferenz in die Nukleotid-bildende Richtung, wobei PolyP verbraucht wird. Zusätzlich konnte durch ein ATP-Recycling System die ADP-Hemmung umgangen werden zugunsten der PolyP-Synthese. Dieses System ermöglichte den Nachweis der PolyP-Bildung mithilfe von 31P-NMR Messungen. Somit präsentiert das erste Kapitel dieser Arbeit eine neuartige PPK, die wir als dTMPK-artige heteromere PPK beschreiben, welche die erste identifizierte und charakterisierte crenarchaelle PPK darstellt. Der zweite Teil dieser Arbeit thematisiert die Untersuchung von Protein-Myristoylierung in S. acidocaldarius. Bis heute wurde die Modifikation von Proteinen durch Myristoylierung überwiegend in Eukaryonten untersucht, es ist aber auch eine Studie aus Euryarchaeen publiziert, die Myristoylierung beschreibt. Dennoch ist diese Art der Protein-Acylierung in Archaeen kaum untersucht worden. Es sprechen aber einige Argumente dafür, dass die Myristoylierung von Proteinen in Archaeen eine Rolle spielt, obwohl Fettsäuren nicht in ihren Membranlipiden vorkommen. Neben der Möglichkeit von einigen archaellen Organismen Fettsäuren verbrauchen zu können, wurde auch die Anwesenheit eines Fettsäurestoffwechsels in S. acidocaldarius nachgewiesen. Außerdem wurde für S. solfataricus, eine NAD+ abhängige Deacetylase (Sir2) beschrieben, welche das Alba Protein deacetylieren konnte. Diese Enzymklasse ist auch dafür bekannt, langkettige Acyl-Modifikationen abspalten zu können, darunter auch Protein-Myristoylierungen. Da auch S. acidocaldarius ein Sir2 Homolog aufweist und nachweislich Fettsäuren synthetisieren und abbauen kann, wurde dieser Organismus verwendet, um die Myristoylierung von Proteinen zu untersuchen. Mithilfe einer bioorthogonalen Markierungsmethode durch eine Myristinsäure-Alkyn-Sonde wurden die entsprechenden Proteine in vivo durch zelluläre Prozesse markiert. Nach dem anschließenden Zellaufschluss, konnte die Sonde an ein Fluorophor mithilfe Kupfer-katalysierter Azid-Alkyn Cycloaddition (CuAAC) gebunden werden. Die in-Gel-Visualisierung veranschaulichte die Ergebnisse dieser Methode und ermöglichte einen ersten Einblick in die Funktionalität dieser Methode. In einem größeren Maßstab wurden die Zelllysate an einen Biotin-Tag gebunden und anschließend mit einem „Avidin-Pulldown“ angereichert. Diese Proben wurden weiter mittels LC-MS/MS Methode analysiert, um somit die markierten Proteine zu identifizieren. Dabei wurden durch die Überlappung der angereicherten Kandidaten drei Proteine Saci_1322, Saci_1188 und Saci_1114 identifiziert. Saci_1322 ist ein Alba Protein, dessen Homolog nachweislich in S. solfataricus als Zielprotein für Protein-Acetylierung und -Deacetylierung nachgewiesen wurde. Saci_1114 ist eine bereits charakterisierte -Ketothiolase, die am Fettsäurestoffwechsel von S. acidocaldarius beteiligt ist. Die Klassifizierung aller markierten Proteine ergab, dass die vorhergesagten Funktionen mit dem Stoffwechsel und der Verarbeitung genetischer Informationen zusammenhängen. Dabei sind die meisten identifizierten Proteine sind am Lipidtransport und –Stoffwechsel sowie an der Energieproduktion und –Umwandlung beteiligt. Darüber hinaus ähneln die Myristoylom-Daten den veröffentlichten Lysin-Acetylom-Daten von Archaeen, was die Vermutung nahelegt, dass Lysin-Myristoylierung in Archaeen vorkommen könnte und somit auch eine mögliche regulatorische Funktion von Stoffwechsel- und zellulären Prozessen umfasst. Um konkrete Aussagen treffen zu können, müssten auf diese Experimente erste Analysen folgen, in denen z.B. die enzymatische Myristoylierung in vitro bestätigt wird. Hierfür können die hier identifizierten Proteine verwendet werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die ersten archaellen Myristoylom-Daten beschrieben wurden, die erste Einblicke in das Vorkommen und die Funktion von Protein-Myristoylierung als mögliche Form der Acylierung in S. acidocaldarius geben.

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