Exploiting natures biodiversity, which is continously becoming more accesible is crucious for the detection of valuable biocatalysts for industrial and environmental applications. Elaborated (meta)genomic tools using Next Generation Sequencing methods, advanced analytical workflows for proteomic analyses and increasing bioinformatical and computational advances supplies researchers with vast numbers of sequence based biological information such as genand protein sequences. However, these information obtained from environmental samples and cultures grown in controlled laboratory conditions oftenly lack information about the activity state at the sampling site under the respective growth conditions and many hidden protein functions cannot be derived from sequence information alone. Thus the main focus of this thesis was the establishment of ABPP for the identification of thermophilic hydrolases in pure cultures, enrichment cultures as well as directly in the environment to close this gap. Glycosyl hydrolases, which were mainly targeted in the chapters 3.1 and 3.3 represent a family of enzymes, which is abundant in all living cells and serves for several vital cell functions, such as aquiring nutrition from complex polysaccharides as well as the synthesis of cell walls and secondary metabolites. Not suprisingly, these enzymes are highly demanded for industrial purposes, especially if they possess thermostable traits like the described glycosidases which where characterized in chapter 3.1. In this project, a recently discovered Thermococcus strain with unusual carbohydrate degrading abilities was described and analyzed with respect to its CAZymes and its growth capabilities on complex carbohydrates, such as xylan, with a novel combined ABPP approach. Noteworthy, in this work, the sucessfull application of glycoside hydrolase specific ABPs in a hyperthermophilic host was described for the first time. In chapter 3.2. the application scope of this approach was broadened to more complex and heterogenous environmental samples from thermophilic springs. An elaborated protocol, combining advanced metagenomic and metaproteomic analyses with well established fluorophosphonated probes for the specific labelling of active serine hydrolases was sucessfully applied, prooving that this concept can also be applied for bioprospecting of thermoactive hydrolases directly in the environment without the need of cultivating desired microbes. In chapter 3.3 the potential of thermophilic β-glucosidases of a hot spring was addressed with combining the before mentioned techniques, such as metagenomic sequencing, metaproteomic analysis and ABPP with a glucosidase specific ABP on a enrichment culture with amorphous cellulose as substrate. The cells which were enriched in this culture, were succesfully labelled with the probe and the best targeted glucosidase was finally heterologously expressed, purified and characterized as a thermostable and highly active β-glucosidase. In summary, this work demonstrates that ABPP in combination with other microbial, bioinformatic and biochemical methods can serve as a valuable tool for the identification and characterization of novel biocatalysts in pure cell culture, enrichment cultures or directly in the environment even under extreme conditions
Die Nutzung der biologischen Vielfalt der Natur, die immer leichter zugänglich wird, ist von entscheidender Bedeutung für die Entdeckung wertvoller Biokatalysatoren für industrielle und umwelttechnische Anwendungen. Ausgefeilte (meta)genomische Werkzeuge unter Verwendung von Next Generation Sequencing-Methoden, fortgeschrittene analytische Arbeitsabläufe für proteomische Analysen und zunehmende bioinformatische und technische Fortschritte versorgen die Forscher mit einer großen Anzahl sequenzbasierter biologischer Informationen wie Gen- und Proteinsequenzen. Diesen Informationen, die aus Umweltproben und unter kontrollierten Laborbedingungen gezüchteten Kulturen gewonnen werden, mangelt es jedoch häufig an Informationen über den Aktivitätszustand an der Entnahmestelle unter den jeweiligen Wachstumsbedingungen, und viele verborgene Proteinfunktionen lassen sich nicht allein aus Sequenzinformationen ableiten. Daher lag der Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Etablierung von ABPP zur Identifizierung von thermophilen Hydrolasen in Reinkulturen, Anreicherungskulturen sowie direkt in der Umwelt, um diese Lücke zu schließen. Glykosylhydrolasen, die in den Kapiteln 3.1 und 3.3 im Mittelpunkt standen, stellen eine Enzymfamilie dar, die in allen lebenden Zellen reichlich vorhanden ist und mehreren lebenswichtigen Zellfunktionen dient, wie z. B. der Gewinnung von Nährstoffen aus komplexen Polysacchariden sowie der Synthese von Zellwänden und Sekundärmetaboliten. Es überrascht nicht, dass diese Enzyme für industrielle Zwecke sehr gefragt sind, insbesondere wenn sie thermostabile Eigenschaften besitzen, wie die in Kapitel 3.1 beschriebenen Glycosidasen. In diesem Projekt wurde ein kürzlich entdeckter Thermococcus-Stamm mit ungewöhnlichen Fähigkeiten zum Abbau von Kohlenhydraten beschrieben und im Hinblick auf seine CAZyme und seine Wachstumsfähigkeit auf komplexen Kohlenhydraten, wie beispielsweise Xylan, mit einem neuartigen kombinierten ABPP-Ansatz analysiert. Bemerkenswert ist, dass in dieser Arbeit zum ersten Mal die erfolgreiche Anwendung von Glykosidhydrolase-spezifischen ABPs in einem hyperthermophilen Wirt beschrieben wurde. In Kapitel 3.2. wurde der Anwendungsbereich dieses Ansatzes auf komplexere und heterogene Umweltproben aus thermophilen Quellen ausgeweitet. Ein ausgearbeitetes Protokoll, das fortgeschrittene metagenomische und metaproteomische Analysen mit gut etablierten fluorophosphonierten Sonden für die spezifische Markierung aktiver Serinhydrolasen kombiniert, wurde erfolgreich angewandt und bewies, dass dieses Konzept auch für die Bioprospektion thermoaktiver Hydrolasen direkt in der Umwelt angewendet werden kann, ohne dass die gewünschten Mikroben kultiviert werden müssen. In Kapitel 3.3 wurde das Potenzial der thermophilen β-Glucosidasen einer heißen Quelle durch die Kombination der zuvor genannten Techniken, wie metagenomische Sequenzierung, metaproteomische Analyse und ABPP mit einem glucosidasespezifischen ABP auf einer Anreicherungskultur mit amorpher Zellulose als Substrat untersucht. Die Zellen, die in dieser Kultur angereichert wurden, wurden erfolgreich mit der Sonde markiert, und die beste zielgerichtete Glucosidase wurde schließlich heterolog exprimiert, gereinigt und als thermostabile und hochaktive β-Glucosidase charakterisiert. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass ABPP in Kombination mit anderen mikrobiellen, bioinformatischen und biochemischen Methoden als wertvolles Werkzeug für die Identifizierung und Charakterisierung neuartiger Biokatalysatoren in reinen Zellkulturen, Anreicherungskulturen oder direkt in der Umwelt selbst unter extremen Bedingungen dienen kann.
