Untersuchungen zur Ultrastruktur endothelialer Mitochondrien bei / nach Kaltlagerung
In der vorliegenden Arbeit wurden ultrastrukturelle Veränderungen der Mitochondrien bei bzw. nach Kaltlagerung in Endothelzellen untersucht. Diese Untersuchungen erfolgten nach Ausschluss bekannter Schädigungsmechanismen der Hypothermie (eisenabhängige Komponente), indem alle Kaltinkubationen in Anwesenheit von Desferal durchgeführt wurden, und es wurden die Veränderungen vergleichend nach Kaltinkubation (reine Kälteexposition, keine Hypoxie) in physiologischer (chloridreich) und chloridarmer Lösung analysiert.
Zunächst konnte eine kälteinduzierte mitochondriale Fragmentation gezeigt werden, welche nach chloridarmer Kaltinkubation stärker ausgeprägt war als nach chloridreicher Kaltinkubation. Diese Fragmentation war nach Wiedererwärmung nach chloridreicher Kaltinkubation komplett reversibel. Nach Wiedererwärmung nach chloridarmer Kaltinkubation hingegen konnte keine Re-Fusion der Mitochondrien beobachtet werden. Unter chloridarmer Kaltinkubation wurde eine verstärkte Prozessierung des Fusionsproteins OPA1 beobachtet.
In der Ultrastruktur wurde zusätzlich zu der mitochondrialen Fragmentation sowohl eine Schwellung der Mitochondrien als auch eine Degeneration der Cristae während der Kaltinkubation beobachtet. Diese Veränderungen waren in der chloridarmen Lö- sung stärker ausgeprägt als in der chloridreichen Lösung und waren nicht nach entsprechender Warminkubation nachweisbar. Die Degeneration der Cristae konnte zusätzlich mittels 3D-Untersuchungen bestätigt werden. Nach kürzeren Kaltinkubationen (3 h) wurden zudem auffällige kugelige Strukturen an Mitochondrien beobachtet, bei denen es sich eventuell um an der Fission beteiligte Strukturen handeln könnte. Diese wurden ebenfalls mittels 3D-Untersuchungen näher beschrieben. Mittels Immunogoldfärbung wurde nachgewiesen, dass diese Strukturen kein Drp1, den Hauptprotagonisten der mitochondrialen Fission unter physiologischen Bedingungen, enthielten. Die mitochondriale Schwellung und der Cristaeverlust waren unter chloridreicher Bedingung in der Wiedererwärmung komplett reversibel. Nach Wiedererwärmung nach chloridarmer Kaltinkubation (> 24 h) wurde hingegen eine Zunahme der Schwellung mit einer ausgeprägten Degeneration der Cristae beobachtet. Im Einklang mit diesen Veränderungen wurde in diesen Zellen ein erniedrigter ATP-Gehalt gezeigt. Darüber hinaus wurden morphologische Veränderungen weiterer Zellorganellen/ Strukturen (ER, Kernmembran und Glykokalyx) nach Kaltinkubation und nach anschließender Wiedererwärmung beobachtet. Diese waren ebenfalls ausgeprägter nach chloridarmer Kaltinkubation und waren nur nach der chloridreichen Kaltinkubation nach der Wiedererwärmung komplett reversibel.
Bei Kaltinkubation konnten damit verschiedene ultrastrukturelle Veränderungen der Mitochondrien beschrieben werden, welche nach chloridreicher Kaltinkubation komplett reversibel waren. Diese Prozesse waren – wahrscheinlich aufgrund der verstärkten OPA1-Spaltung – nach chloridarmer Kaltinkubation hingegen irreversibel und hatten funktionelle Auswirkungen im Sinne eines ATP-Mangels, der die Ursache der weiteren irreversiblen zellulären Veränderungen darstellen könnte. Hier ist es nun wichtig, die Mechanismen, die diese mitochondrialen Veränderungen auslösen, wie die kugeligen Strukturen und das OPA1-spaltende Enzym, zu identifizieren, um hier therapeutisch anzusetzen, da aktuell verwendete Konservierungslösungen chloridarm sind.
First, a cold-induced mitochondrial fragmentation was shown, which was more pronounced after low-chloride cold incubation than after high-chloride cold incubation. This fragmentation was completely reversible during rewarming after chloride-rich cold incubation. In contrast, re-fusion was not observed after rewarming following low-chloride cold incubation. Enhanced processing of the fusion protein OPA1 was observed during low-chloride cold incubation.
In ultrastructure, it was observed that, in addition to mitochondrial fragmentation, both swelling of mitochondria and degeneration of cristae occurred during cold incubation. These changes were more pronounced in the low-chloride than in the high-chloride solution and were not detectable after corresponding warm incubation. The degeneration of the cristae could be confirmed with 3D analysis. After shorter cold incubations (3 h), peculiar spherical structures were observed in/between mitochondria, which could possibly be structures involved in fission. These were also described in more detail using 3D analysis. Immunogold staining showed that these structures did not contain Drp1, the main protagonist of mitochondrial fission under physiological conditions. Mitochondrial swelling and cristae loss were completely reversible during rewarming after chloride-rich cold incubation. In contrast, an increase in swelling with pronounced degeneration of cristae was observed upon rewarming after low-chloride cold incubation (>24 h). Also, decreased ATP content was measured in these cells. In addition, morphological changes of further cellular organelles/structures (ER, nuclear membrane and glycocalyx) were observed after cold incubation and after subsequent rewarming. These were also more pronounced after low-chloride cold incubation and were completely reversible only during rewarming after high-chloride cold incubation.
Thus, during cold incubation, various ultrastructural changes of the mitochondria could be described, which were completely reversible during rewarming after chloride-rich cold incubation. In contrast, these processes were irreversible during rewarming after low-chloride cold incubation – probably due to increased OPA1 cleavage – and had functional effects in terms of ATP deficiency, which could be the cause of the further irreversible cellular changes. It is now important to elucidate the mechanisms that trigger these mitochondrial alterations, e. g. to identify the spherical structures and the OPA1-cleaving enzyme, in order to develop therapeutical approaches adressing these processes, since currently used organ preservation solutions are low in chloride.