Chemotherapie-Resistenzen bei humanen Retinoblastomen : Untersuchungen molekularer Mechanismen und Entwicklung neuartiger Behandlungsansätze

Das Retinoblastom (RB) ist weltweit eine der häufigsten malignen okulären Erkrankungen des frühen Kindesalters, bei der diverse Therapieoptionen eine bis zu 97%-ige Überlebesrate von Patienten ermöglichen. Trotz der hohen Überlebensrate bergen Chemotherapie-basierte Behandlungen das Risiko der Resistenzentwicklung bei den zu behandelnden Tumorzellen, was eine Gefahr für das Überleben der Patienten darstellt. Die Resistenzentstehung gegenüber Chemotherapeutika im Retinoblastom kann durch eine Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen bedingt sein, welche bisher jedoch nicht vollständig geklärt sind. In der vorliegenden Dissertation wurden daher molekularbiologische Mechanismen der Resistenzentstehung und der erhöhten Tumorigenität anhand der Expressions- und Phosphorylierungsmuster bestimmter Krebs-assoziierter Proteine in Etoposid-resistenten RB Zellen untersucht und die daran beteiligten Gene und Signalwege identifiziert. Als eines der potentiell an der Resistenzentstehung beteiligten Gene wurde INPP4B, ein Tumorsuppressor aus dem PI3K/AKT Signalweg, identifiziert. In Patientenproben sowie chemosensitiven und resistenten RB Zelllinien konnten unterschiedliche Expressionsmuster von INPP4B nachgewiesen werden. Um die Rolle von INPP4B im Retinoblastom zu beschreiben, wurden funktionelle Untersuchungen nach einer lentiviralen Überexpression von INPP4B in Etoposid-resistenten RB Zellen durchgeführt. INPP4B Überexpression führte zur signifikanten Reduktion der Zellviabilität, des Zellwachstums, der Proliferation, des kontaktunabhängigen Wachstums sowie des in ovo Tumorwachstums. INPP4B Überexpression führte außerdem zur signifikanten Erhöhung der Apoptoserate in Etoposid-resistenten RB Zellen. Darüber hinaus konnte nach INPP4B Überexpression eine verringerte Expression von SGK und eine erhöhte Expression von p-SGK3 nachgewiesen werden, was auf die potentielle Regulation des SGK3 Signalweges in Etoposid-resistenten RB Zellen hindeutet.

 

Um die in den vorherigen Arbeiten unserer Arbeitsgruppe erzielten Ergebnisse bezüglich der erhöhten Tumorigenität Etoposid-resistenter RB Zellen in einer nativen orthotopen Umgebung zu überprüfen und ein Modellsystem zur Testung neuartiger Behandlungsansätze zu schaffen, wurde in der vorgelegten Dissertation erfolgreich ein in vivo Xenograftmodell an neonatalen Ratten etabliert. Die erhöhte Tumorigenität der Etoposid-resistenten RB Zellen konnte in vivo bestätigt werden und es konnte zusätzlich gezeigt werden, dass ein Versuchszeitraum von 14 Tagen für dieses Tierversuchsmodel optimal geeignet ist. Im Hinblick auf neuartige Behandlungsansätze wurde in der vorliegenden Dissertation die Wirksamkeit von mit atrialen natriuretischen Peptid (ANP) und Hyaluronsäure (HA) gekoppelten Goldnanopartikeln (GNPs) an Etoposid-resistenten RB Zellen im Chorioallantoismembran (CAM) Modell untersucht. Anhand einer signifikanten Reduktion der Tumorgröße, des Tumorgewichtes und der Tumorbildungskapazität nach einer Behandlung mit ANP-HA-GNPs konnte deren antitumorigene Wirkung in vivo nachgewiesen werden.

 

Eine immense Rolle bei der Tumorentstehung und der Entwicklung von Therapieresistenzen spielt neben den molekularen Mechanismen der Einfluss des Therapie-induzierten Sekretoms (TIS). Anhand der im Rahmen diesder Arbeit etablierten Methode zur Isolierung des Sekretom-haltigen Zellkulturüberstandes (konditioniertes Medium (KM)) und des in vitro Ko-Kultivierungssystems konnte gezeigt werden, dass die Viabilität und das Wachstum resistenter RB Zellen durch das TIS sensitiver Zellen gesteigert werden.

 

Chemotherapie-basierte Behandlungen und die zusätzliche Anwendung weiterer Chemotherapeutika im Falle eines Rezidivs oder eines metastasierenden RBs können zur Entstehung nicht nur einzelner, sondern auch multipler Resistenzen führen und somit eine Gefahr für das Überleben der RB Patienten darstellen. Insgesamt konnte in der vorliegenden Dissertation gezeigt werden, dass Etoposid-resistente RB Zellen multiple Resistenzen gegenüber Paclitaxel und Vincristin oder Melphalan und Vincristin entwickeln. Um die Entstehung multipler Resistenzen zu verhindern, könnten bei den rezidivierenden oder metastasierenden RBs alternative Behandlungsmethoden wie antitumorigene Goldnanopartikel eingesetzt werden
Retinoblastoma (RB) is one of the most common malignant ocular diseases in early childhood worldwide, with various treatment options enabling a patient survival rate of up to 97%. Despite the high survival rate, chemotherapy-based treatments carry the risk that treated tumor cells develop resistances, posing a threat to patients’ survival. The emergence of resistance to chemotherapeutic agents in retinoblastoma is potentially caused by a variety of different mechanisms, which have not yet been fully elucidated. Therefore, in the present dissertation, molecular-biological mechanisms of resistance development and increased tumorigenicity were investigated using the expression and phosphorylation patterns of certain cancer-associated proteins in etoposide-resistant RB cells. Further, based on this data, the corresponding involved genes and signaling pathways were identified. INPP4B, a tumor suppressor of the PI3K/AKT signaling pathway, was identified as one of the genes, which are potentially involved in the development of resistance. Furthermore, different expression patterns of INPP4B could be detected in RB patient samples as well as in chemosensitive and resistant RB cell lines. To characterize the role of INPP4B in retinoblastoma, functional studies were performed after lentiviral overexpression of INPP4B in etoposideresistant cells. Lentivirus-mediated INPP4B overexpression led to a significant reduction in cell viability, cell growth, proliferation, contact-independent growth and in ovo tumor growth. INPP4B overexpression also led to a significant increase in apoptosis in etoposide-resistant RB cells. Furthermore, after INPP4B overexpression, a reduced expression of SGK and an increased expression of p-SGK3 could be detected, indicating the potential regulation of the SGK3 signaling pathway in the etoposide-resistant RB cells.

 

In order to verify data obtained in previous work of our group regarding increased tumorigenicity of etoposide-resistant cells in a native orthotopic environment and to create a model system for testing novel treatment approaches, an in vivo xenograft model on neonatal rats was successfully established in the dissertation presented. Increased tumorigenicity of etoposide-resistant RB cells could be confirmed in vivo and it could also be shown that a test period of 14 days is optimally suited for this animal model. With regard to novel treatment approaches, in the dissertation presented, the effectiveness of gold nanoparticles (GNPs) coupled with atrial natriuretic peptide (ANP) and hyaluronic acid (HA) on etoposide-resistant RB cells was investigated in a chorioallantoic membrane (CAM) model. An anti-tumorigenic effect of the ANP-HAGNPs was revealed by a significant reduction in tumor size, tumor weight and tumor formation capacity.

 

In addition to molecular mechanisms, the influence of the therapy-induced secretome (TIS) plays an immense role in tumor formation and development of therapy resistance. Establishing a method for isolating the secretome-containing cell culture supernatant (conditioned medium (CM)) and an in vitro co-cultivation system, it could be shown that viability and growth of resistant RB cells are increased by the TIS of sensitive cells.

 

Chemotherapy-based treatments and the additional use of other chemotherapeutic agents in reccurent or metastatic RB can lead to the development of single or even multiple resistances, posing a threat to the survival of RB patients. Overall, the dissertation presented revealed that etoposide-resistant RB cells develop multiple resistances to paclitaxel and vincristine or melphalan and vincristine. In order to prevent the emergence of multiple resistances, alternative treatment methods such as antitumorogenic gold nanoparticles could be used in the cases of recurrent or metastatic RBs.

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