Exploring the role of a novel Beclin 1 interactor in autophagy
Autophagy is a highly conserved intracellular degradation process by which organelles and cytoplasmic components are sequestered into autophagosomes to be ultimately degraded by lysosomes. BECN1 is a happloinsufficient tumor suppressor monoallelically deleted in multiple cancers. The BECN1 gene encodes f-or BECN1, an essential autophagy protein that is part of the PI3K Class III complexes and involved in autophagosome formation. The role of autophagy in cancer is complex and context dependent.
GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2), is an adaptor HER2 interacting protein that our group identified as a potential BECN1 interacting partner in a large-scale autophagy proteins network screening. Thus, the goal of this thesis was to characterize this novel BECN1 autophagy interactor and its effects in autophagy as well as its implication in tumour growth.
We showed that GRB2 immunoprecipitated with BECN1. In addition, a mutation analysis based on in silico data indicated that even though all the mutants analyzed were still able to bind to BECN1, they have different effects on autophagy. GRB2 knockdown induced autophagy independently of the mTORC1 and MAPK pathways, and GRB2 overexpression inhibited autophagy. In addition, we identified that GRB2 mutants Y52A and R86A-S88A impaired the autophagy-inhibiting function of the GRB2-WT.
Furthermore, GRB2 knockdown does not affect the binding of well-known partners of BECN1 (ATG14, VPS34, Rubicon or BCL2) to BECN1, indicating that GRB2 could potentially act through the modulation of other pathways or binding partners. A deeper analysis on the potential mechanism whereby GRB2 regulates autophagy through BECN1 indicated that GRB2 knockdown resulted in an induction of the VPS34 catalytic activity. Finally, in vivo studies in a CAM (Chicken Chorioallantoic Membrane) model indicated that GRB2 knockdown as well as Y52A and S86A-R88A GRB2 mutants overexpression compromised tumour growth as compared to the controls. These differences in tumor growth correlated with differential autophagy activity, potentially indicating that autophagy effects could be related to the effects on tumorigenesis.
Overall, these results highlight a novel function of GRB2 as a BECN1 binding protein and a regulator of autophagy.
Autophagie ist ein hochkonservierter intrazellulärer Abbauprozess, bei dem Organellen und zytoplasmatische Bestandteile in Autophagosomen eingelagert werden, um schliesslich von Lysosomen abgebaut zu werden. BECN1 ist ein erfolgreich ungenügender Tumorsuppressor, der bei mehreren Krebsarten, einschliesslich Brustkrebs, monoallel eliminiert wird. Das BECN1-Gen kodiert für Beclin 1, ein essentielles Autophagieprotein des PI3K-Klasse-III-Komplexes, das an der Autophagosomenbildung beteiligt ist. Die Rolle der Autophagie bei Krebserkrankungen ist komplex und kontextabhängig.
GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2), ist ein HER2-interaktives Adapterprotein, das unsere Gruppe bei einem gross angelegten Autophagie-Protein-Netzwerk-Screening als potenzieller BECN1- Interaktionspartner identifiziert hat. Ziel dieser Arbeit war es daher, einen neuartigen BECN1- Autophagie-Interaktor zu identifizieren und seine Auswirkungen auf die Autophagie sowie seine Auswirkungen auf das Tumorwachstum zu charakterisieren.
Wir haben gezeigt, dass GRB2 mit BECN1 immunopräzipitiert wurde. Um die Schlüsselregionen zu identifizieren, die für die BECN1/GRB2-Komplexbildung verantwortlich sind, wurde eine Deletionsanalyse mittels In-silico-Analyse durchgeführt. Weitere Analysen zeigten, dass alle untersuchten Mutanten zwar noch in der Lage waren, an BECN1 zu binden, aber unterschiedliche Auswirkungen auf die Autophagie haben. GRB2 induzierte Autophagie unabhängig von den mTORC1- und MAPK-Signalwegen und GRB2 Überexpression hemmte die Autophagie. Darüber hinaus konnten wir feststellen, dass die GRB2-Mutanten Y52A und R86A-S88A die autophagiehemmende Funktion des GRB2-WT beeinträchtigen.
Darüber hinaus beeinflusst GRB2 die Bindung bekannter BECN1-Partner (ATG14, VPS34, Rubicon oder BCL2) an BECN1, was darauf hindeutet, dass GRB2 möglicherweise über die Modulation anderer Signalwege oder Bindungspartner wirkt. Eine eingehendere Analyse des potentiellen Mechanismus, durch den GRB2 die Autophagie über BECN1 reguliert, ergab, dass GRB2 zu einer Induktion der katalytischen VPS34-Aktivität führte. In-vivo-Studien an einem CAM-Modell (Chicken Chorioallantoic Membrane) zeigten, dass GRB2-Knockdown sowie die GRB2-Mutanten Y52A und S86A-R88A das Tumorwachstum im Vergleich zu den Kontrollgruppen beeinträchtigten, die mit der differentiellen Autophagieaktivität korrelierten.
Insgesamt weisen diese Ergebnisse auf eine neuartige Funktion von GRB2 als neuer Regulator der Autophagie durch BECN1 hin.