Kovalente Oberflächenfunktionalisierung von ultrakleinen metallischen Nanopartikeln

In dieser Arbeit konnten eine Reihe ultrakleiner Goldnanopartikel hergestellt werden. Eine Zusammenfassung der wichtigsten Charakterisierungsdaten ist in Tabelle 4 zu finden. Glutathion-terminierte Goldnanopartikel (AuGSH) konnten dabei durch eine einfache Synthese in großem Maßstab (~50 mg) synthetisiert werden und dienten als Grundlage für ein neu etabliertes System zur kovalenten Oberflächenfunktionalisierung. Nach Fertigstellung und Charakterisierung der AuGSH Nanopartikel als Grundlage, wurden diese über einen Diazotransfer an der frei liegenden Aminogruppe umfunktionalisiert, um mit der resultierenden Azidogruppe ein breites Spektrum von kupferkatalysierten Azid-Alkin Cycloadditionsreaktion (CuAAC) zu öffnen. Dass die CuAAC an der Oberfläche von ultrakleinen Nanopartikeln funktioniert, konnte bereits in vorherigen Arbeiten nachgewiesen werde, jedoch bietet dieser neue Reaktionsweg einen deutlich kostengünstigeren und chemisch genau definierten Ansatz der Oberflächenfunktionalisierung. Nach dem Diazotransfer auf AuGSH-Nanopartikel konnte mittels IR-Spektroskopie eindeutig die neu entstandene Bande für die N3-Streckschwingung charakterisiert werden. Außerdem war im 1H-NMR-Spektrum die diastereomere Aufspaltung der zur Azidogruppe benachbarten Protonen zu erkennen. Das 13C-NMR-Spektrum zeigte zudem eine deutliche Tieffeldverschiebung für das stereomere Kohlenstoffatom in direkter Nachbarschaft zur Azidogruppe. Über ein zweidimensionales 1H13C-HSQCNMR-Spektrum konnte ein Umsatz von NH2 zu N3 von rund 95% ermittelt werden, womit ein Nanopartikel nach Umfunktionalisierung etwa 118 Azidogruppen auf seiner Oberfläche trägt. Die azidierten Nanopartikel AuN3 konnten mit verschiedenen Farbstoffen geklickt werden und waren dann im Gegensatz zu den freien Farbstoffmolekülen in der Lage, durch die Membranen von HeLa, CT-26 und MODE-K Zellen zu dringen. Außerdem konnten sie durch ihre ultrakleine Größe auch durch die dünnen Proteinkanäle in den Zellwänden von E. coli Bakterien in das Innere der Zellen eindringen. Dabei liegen diesem Prozess wahrscheinlich eine Kombination aus aktiven Aufnahmemechanismen der Zellen und passiver Diffusion zu Grunde. 3D-Modelle des menschlichen Darms konnten durch die anliegende Schleimschicht die Nanopartikel in einem Maße aufnehmen, wie es für Färbemittel der biologischen Bilddarstellung nicht möglich war. Dabei sind die Nanopartikel durch die dicht gepackte Oberfläche der Zellen gedrungen und auch dahinter durch unterschiedliche Prozesse von Zelle zu Zelle gewandert. CuAAC mit wasserunlöslichen AIE-Farbstoffen zeigte zudem, dass die Nanopartikel mit der sehr gut wasserlöslichen GSH-Matrix nach hochgradiger Funktionalisierung mit hydrophoben Liganden trotzdem sehr gut in Wasser dispergierbar waren. Sie waren dazu in der Lage, diese Liganden trotz der schlechten Wasserlöslichkeit durch Zellmembranen zu transportieren. Chlorohexyl-tragende Liganden konnten über organisch-chemische Methoden erfolgreich synthetisiert und analysiert werden. Sie konnten zudem ähnlich wie die AIEFarbstoffe trotz sehr schlechter Wasserlöslichkeit auf die Oberfläche der AuN3- Nanopartikel geklickt werden. Versuche mit dem Modellprotein HT2 zeigten, dass die Nanopartikel erfolgreich dabei waren, die für den Chlorohexyl-Rest vorgesehenen Bindungstaschen des Proteins zu binden, allerdings konnten keine Oligomere mit metallischem Zentrum durch Größenausschlusschromatographie ermittelt werden. Potenziell waren die verwendeten Linker nicht lang genug, sodass nicht so viele Proteine gleichzeitig wirklich kovalent auf der Oberfläche der Nanopartikel mmobilisiert werden konnten. Daher wurde ein zweiter, längerer Linker für den Chlorohexyl-Rest synthetisiert, der erfolgreich an die Oberfläche der Nanopartikel in geringerer Zahl angeklickt werden konnte. Dadurch sollte den Proteinen insgesamt deutlich mehr Platz zur Verfügung stehen, sodass sie irreversibel an die Nanopartikel binden. Die Nanopartikel wurden ebenfalls mit den bereits etablierten molekularen Pinzetten funktionalisiert. Dabei sollten sie durch Anbindung an basische Aminosäuren in der Nähe der Anbindungsstelle von Importin α an Taspase1 binden. Durch diese Anbindung sollte die Importin α-Taspase1-Interaktion so gestört werden, dass Taspase1 nicht mehr in den Zellkern gelangt, wo es dann von der cis- in die transForm umgewandelt wird und katalytisch aktiv andere Proteine spalten kann. Da Taspase1 die Spaltung krebsrelevanter Proteine und somit die Entstehung von Krebs katalysieren kann, bietet die Störung dieser Interaktion einen vielversprechenden Ansatz in der Krebsforschung, insbesondere für Leukämie. Über einen Pull-Down Assay sowie anschließender SDS-PAGE konnte damit ein IC50 von ca. 10 µM für das AuTweezer Partikelsystem bestimmt werden. Somit bieten die Nanopartikel eine bis zu dreimal höhere inhibitorische Aktivität als zuvor verwendete GCP-Liganden. Zusätzlich zur Störung der Importin α-Taspase1-Interaktion hatten die Nanopartikel noch den Effekt, dass sie die katalytische Aktivität von Taspase1 generell stark reduzierten. Dabei lag der IC50 der Nanopartikel bei 200 nM eingesetzter Taspase1 bei nur 100 nM. Zuletzt wurden noch ultrakleine Goldnanopartikel mit einem makromolekularen Liganden synthetisiert, der über zwei Azidogruppen später noch in einer CuAAC mit den molekularen Pinzetten geklickt wurde. Über UV-Vis-Spektroskopie konnten 75 Liganden auf der Oberfläche der Nanopartikel berechnet werden, die 150 Azidogruppen entsprechen würden. Nach Funktionalisierung mit den Pinzetten erwies es sich als schwierig, die genaue Anzahl der Pinzetten auf der Oberfläche der Nanopartikel zu bestimmen. Daher wurden die Proben mittels ICP-MS vermessen, wobei etwa zehn Pinzetten pro Nanopartikel bestimmt werden konnten. Trotz der sehr großen Liganden waren die Nanopartikel weiterhin in der Lage, die Zellmembranen zu durchdringen, was ein vielversprechender erster Schritt im Hinblick auf die Inhibition der Survivin-Crm1-Interaktion ist.

During the course of this work, various nanoparticle systems were successfully synthesized. A summary of the most important data can be found in Table 4. Glutathione-bearing nanoparticles (AuGSH) could be synthesized on a high scale (~50 mg) according to a new synthetic pathway and were then used to establish a new convenient system for covalent surface functionalization. After the successful synthesis and characterization of AuGSH, they were functionalized via diazo transfer reactions to the superficial amine groups of the ligand. The resulting azido group could then be utilized for various copper-catalyzed azide alkyne cycloadditon reactions (CuAAC). CuAAC on the surface of ultrasmall metallic nanoparticles has already been tested in previous studies. However, this new synthetic pathway opens up an advantageous approach with the possibility of a well-defined azide structure on the nanoparticles surface. After the diazo transfer reactions on AuGSH nanoparticles, there was a prominent azide stretching vibration visible in the corresponding IR spectra. On top of that, the 1H-NMR-spectrum revealed diastereomeric separation for the protons in close proximity to the newly formed azide. Additionally, the 13C-NMR-spectrum revealed a strong downfield shift for the carbon atom in direct proximity to the azide. A two-dimensional 1H13C-HSQC-NMR-spectrum could be used to quantify the yield of the azidation at around 95%, which is equivalent to about 118 azido groups on the surface of each particle. The azidated nanoparticles (AuN3) could be clicked to various fluorescent dyes and were able to carry them through the cell membrane of HeLA, CT-26 and MODE-K cells. In comparison, the pure dyes were not able to enter the cells. Additionally, the nanoparticles were able to penetrate E. coli bacteria through their thin protein channel in the cell walls. This process is probably mostly comprised of active intake mechanisms by the cells themselves together with passive diffusion of the nanoparticles. 3D human gut cell models were able to take in the nanoparticles even through the thin mucus layer on their surface. The used fluorescent cell markers however were only able to dye the cell on the surface of the 3D models and could not penetrate the tight junction between individual cells. Nanoparticles on the other hand were localized throughout the whole organoid. CuAAC with insoluble AIE-dyes revealed that the nanoparticles foundation of AuN3 is capable to be dispersed even while carrying a high number of insoluble molecules. AuAIE nanoparticles were able to transport the insoluble dye through cell membranes of HeLa cells. Chlorohexyl-containing ligands were successfully synthesized and characterized by different organic chemical methods. Similar to AuAIE, they were able to be linked to the badly soluble H1 and H2 ligands. Experiments on the model protein HT2 revealed the nanoparticles to be able to bind every single binding pocket of the proteins, although no oligomers with a metallic center could be found by size-exclusion chromatography. One possible reason for this may be that the linkers to the functional chlorohexyl group were too short, resulting in incomplete binding of the proteins due to steric hinderance. For this reason, a second, longer linker was developed (H2) and clicked to the surface of the nanoparticles even in lower number to give more room to the proteins. Another project included the nanoparticles and the already well-established molecular tweezers. Attachment of the tweezer to the nanoparticles surface should give an opportunity to bind basic amino acids on the protein Taspase1 which would otherwise be open for the attachment of Importin α. This binding to a specific location on the protein should interfere with the Importin α-Taspase1-interaction in a way that prevents Taspas1 from entering the nucleus where it is transformed into its catalytically active trans form. The trans form is able to disrupt cancer relevant proteins, which is a process that may result in different types of cancer, but mostly leukemia. A Pull-Down Assay followed by an SDS-PAGE revealed an IC50 for AuTweezer of around 10 µM, which is translated to a binding to Taspase1, which is about three times stronger than previously tested GCP ligand. Additionally, the nanoparticles were able to interfere with the proteolytic activity of Taspase1. The IC50 for the inhibitory effect to the catalytic properties of the protein were around 100 nM at 200 nM protein concentration. Nanoparticles were functionalized with macromolecular ligands, which were comprised of two azido groups each. UV-Vis-spectroscopy revealed a total number of immobilized macromolecules of 75, which is equivalent to 150 azido groups. After functionalization of the azido groups with molecular tweezers, the total number of attached tweezers was difficult to quantify with UV-Vis-spectroscopy and NMR-spectroscopy. ICP-MS measurements revealed around ten tweezer per nanoparticle. Despite carrying large ligands, the nanoparticles were able to penetrate the cell membrane of cancer cells, which makes up a great first step towards inhibition of Survivin-Crm1 interaction.

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