Entwicklung einer DIP-EESI-MS und der Einsatz von ambienten Ionisationsmethoden zur Analyse von Arzneimitteln

In der vorliegenden Arbeit wurde das Einsatzgebiet der Direkt Inlet Probe um die ambiente Ionisationsmethode der DIP-EESI erweitert, so dass nun alle drei Ionisationsmethoden (ESI, APCI und APPI) genutzt werden können. Die entwickelte DIP-EESI-Ionenquelle wurde mit Hilfe der Multipropose-Quelle an ein Ion Trap-Massenspektrometer (Bruker Daltonik) gekoppelt. Für diese Kopplung wurden die Position des Sprayers, die verschiedenen Gas- und Flüssigkeitsströme, die anliegende Spannung und die Länge der Sprayerkapillare des handelsüblichen ESI-Sprayers (Bruker Daltonik) optimiert. Durch den Einsatz der DIPEESI ist es möglich auch Substanzen zu analysieren, die mit der DIP-APCI oder DIP-APPI nur schlecht oder gar nicht zugänglich sind. So ließen sich mit der DIP-EESI unter Verwendung von Reinsubstanzen, die sich gut mit der DIP-EESI ionisieren ließen, niedrigere Nachweis- und Bestimmungsgrenzen ermitteln, als mit der DIP-APCI bzw. DIP-APPI. Das ESI-Spray erzeugte nur eine geringe Hintergrundbelastung, wodurch eine mit der DIP-APCI vergleichbare Basislinienhöhe beobachtet wurde. Die DIP-EESI ist mit einem Arbeitsbereich für die quantitative Analyse zwischen ca. 20 und 100 ng/µL als genauso leistungsstark einzuordnen, wie die DIP-APCI oder DIP-APPI. Auch im Vergleich mit verwandten Verfahren, die den gleichen Ionisationsmechanismus nutzen und in der Literatur [1–3] beschrieben wurden, konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Aufgrund der geringeren Heizleistung der DIP-EESI gegenüber der DIP-APCI und DIP-APPI ließen sich bessere Ergebnisse für Substanzen mit niedrigen Siedepunkten erreichen. Mit der DIP-EESI und der DIP-APCI ließ sich eine schnelle Methode entwickeln, mit der temperaturstabile Medikamente untersucht und ein Screening auf unbekannte Verunreinigungen durchgeführt werden konnte. Die genutzte Methode konnte mit geringen Modifikationen für Substanzen mit einem höheren Siedepunkt auf alle untersuchten Arzneimittel angewendet werden. Auf eine Probenvorbereitung bzw. Verdünnung konnte nicht verzichtet werden, da selbst bei der kleinstmöglichen Einwaage der Wirkstoff noch nach mehrstündigem Ausheizen der Quelle nachgewiesen werden konnte. Die quantitative Analyse von temperaturlabilen Substanzen wie Acetylsalicylsäure und das Screening auf Verunreinigungen dieser Substanzen ist mit der DIP-EESI nicht möglich. Allerdings können die thermischen Zersetzungsprodukte in situ nachgewiesen und strukturell aufgeklärt werden. Für Medikamente, deren Verdampfungs- und Zersetzungstemperatur weit genug auseinander liegen, wird nicht ausgeschlossen, dass sie durch Anpassen der DIP-EESI Methode untersucht werden können. Mit der DIP-EESI wurden halbierte und für die patientenindividuelle Zweitverblisterung umverpackte Tabletten, die bei Tageslicht in einem durchsichtigen Kunststoffbehälter bis zu 3 Jahre lang gelagert wurden sowie original verpackte Tabletten auf Unterschiede untersucht. Für Clonazepam und Primidon wurde eine signifikante Abnahme der Wirkstoffkonzentration in den umverpackten Tabletten festgestellt. Für die Bestimmung der Wirkstoffkonzentration der untersuchten Medikamente wurden mit der DIP-EESI relative Standardabweichungen von 1,2 % bis 9,4 % und der DIP-APCI von 1,0 % bis 16,7 % erhalten. Zum Teil liegen die Werte bereits innerhalb der vom Arzneibuch geforderten Grenze von 4,2 %. Durch Automatisieren des Systems können die Schwankungen minimiert werden, wodurch eine arzneibuchkonforme Gehaltsbestimmung des Wirkstoffes möglich wird. Darüber hinaus wurde ein Screening auf bekannte und unbekannte Verunreinigungen in den Tabletten durchgeführt. Durch Isolierung der Verunreinigung können je nach Medikament die im Arzneibuch geforderten Bestimmungsgrenzen der Verunreinigungen eingehalten werden. Viele der bekannten Verunreinigungen konnten mit DIP-EESI sowie mit DIP-APCI detektiert werden. Aufgrund des Ionisationsmechanismus wurden in den meisten Fällen die bekannten Verunreinigungen mit der DIP-APCI besser ionisiert, als mit der DIP-EESI. Erwartungsgemäß wurden mit der DIP-EESI die unpolaren Hilfsstoffe wie Stärke, Stearat oder Povidon gar nicht oder nur in geringen Maße Ionisiert, wodurch eine Störung dieser Stoffe minimiert und ein Screening auf unbekannte Verunreinigungen sowie die Identifizierung bekannter Verunreinigungen ermöglicht wurde. In diesem Fall wurden die Verunreinigungen besser mit der DIP-EESI detektiert. Eine Identifizierung über MSn -Untersuchungen war mit beiden Ionisationsmethoden bei ausreichend hoher Konzentration der ionisierten Verunreinigungen möglich. Bei der Untersuchung von unbekannten Substanzen mit der DIP-EESI konnten mit Hilfe des Temperaturgradienten der DIP die Substanzen mit gleicher Masse soweit getrennt werden, dass sie einzeln voneinander fragmentiert und untersucht werden konnten. Hier konnte z.T. eine ausreichende Menge an Fragmenten erzeugt werden, um eine Struktur zu postulieren. Andere sich überlagernde Verunreinigungen, auch mit dem Wirkstoff, konnten nicht oder nur unzureichend getrennt werden. Eine Identifizierung dieser Substanzen war z.T. möglich, wenn das Fragmentierungsmuster bekannt war, oder gezielt die Verunreinigung oder ein bekanntes Fragment der Verunreinigung fragmentiert werden konnte. In anderen Situationen könnte die Kopplung an ein MS mit besserer Auflösung die Identifizierung der Verunreinigungen erleichtern. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nicht geklärt werden, ob die beobachteten Verunreinigungen in der Tablette selbst vorlagen, oder ob sie durch thermische Reaktionen bei der Untersuchung entstanden sind. Dadurch könnten Abbauprodukte fälschlicherweise als Wirkstofffragmente identifiziert werden. Diese Substanzen können nur vom Wirkstoff unterschieden werden, wenn sich die EICs des Wirkstoffs und der potentiellen Verunreinigung ausreichend unterscheiden. Insgesamt konnte mit der DIP-EESI ein schnelles Verfahren zur Analyse von Arzneimitteln entwickelt und das Potential der Methode gezeigt werden.

The present thesis is concerned with the development and optimisation of an ion source with a direct inlet system and based on electrospray ionisation for the analysis of pharmaceuticals. Because the ionisation mechanism of the new ion source is most likely based on the mechanism of extractive ESI, it is named DIP-EESI. After optimisation of the source parameters, lower detection and quantification limits could be determined with the DIP-EESI-MS than with the DIP-APCI or DIP-APPI using pure substances that could be ionised well with the DIP-EESI. Only a low background level was generated by the ESI spray, resulting in a baseline level comparable to that observed with the DIP-APCI. The DIP-EESI can therefore be classified as having the same performance as the DIP-APCI. Comparable results were also obtained in comparison with related methods using the same ionisation mechanism of the EESI described in the literature [1–3]. Based on the results obtained with the pure substances, the DIP-EESI could be applied for the analysis of pharmaceuticals. In the analysis of pharmaceuticals, the DIP-EESI showed lower intensities of the active substances compared to the DIP-APCI due to the EESI mechanism. However, the DIP-EESI also shows a lower ionisation of excipients, such as starch, stearate or povidone. This minimises interference from excipients and allows screening for unknown impurities and identification of known impurities. Quantitative analysis of temperature-stable substances such as acetylsalicylic acid and screening for impurities is not possible with the DIP-EESI. However, the thermal decomposition products can be detected in situ and structurally elucidated. With the DIP-EESI and the DIP-APCI, a rapid method could be developed to investigate the temperaturestable pharmaceuticals and to screen for unknown impurities. This method could be applied to all the pharmaceuticals examined without the need for time-consuming method development. However, the active ingredients of the tablets had to be dissolved because they were so well ionised that even with the smallest possible sample weight, the active ingredient could still be detected after the source had been heated up for several hours. The DIP-EESI was used to examine tablets that had been halved and repackaged for patient-specific secondary blistering. These tablets were stored in their original or new packaging in a translucent plastic container in daylight without further precautions on the laboratory bench for up to 3 years. Solutions of these tablets containing an amount of the active ingredient that could be analysed with DIPEESI were compared with each other. Of nine substances investigated, a significant difference in the concentration of active ingredient in the tablets was found for clonazepam and primidone between the original and repackaged tablets. The relative standard deviations for the assay of the active ingredients were on average 4.3 %. In addition, screening for known impurities in the tablets was performed. The DIP-EESI is so sensitive that it can still detect these impurities in the commercially available tablets, even though their content is below the maximum permitted limit. An identification of the known impurities could be done via fragmentation reactions. The results obtained with DIP-EESI were compared with those from DIP-APCI and HPLC-ESI-MS investigations and partially confirmed. Since the DIP-EESI is less susceptible to interference by auxiliary substances than the DIP-APCI, it was also possible to screen solutions with a high content of dissolved auxiliary substances for unknown impurities or conspicuous masses. Some of the unknown substances detected in the tablet solution could be separated via the temperature gradient of the DIP to such an extent that they could be fragmented individually from one another and examined. For example, with the DIP-EESI, five different substances could be detected in amlodipine tablets due to the separation, which would have been detected as one substance without temperature separation. A structure could be postulated for some of these substances. It was possible to develop a rapid procedure for the analysis of pharmaceuticals with the DIP-EESI and to demonstrate the potential of the method.

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