New strategies to improve Natural Killer cells for “off-the-shelf” allogeneic immunotherapy
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind ein wesentlicher Teil der angeborenen Tumor-Immunüberwachung im menschlichen Körper. Im Gegensatz zu T-Zellen verursachen NK-Zellen keine Graft-versus-Host-Erkrankung, wenn sie in allogene, nicht HLA-identische Empfänger übertragen werden. Daher scheinen NK-Zellen optimal als universelle Spenderzellen für eine Immuntherapie "off-the-shelf" geeignet. Jedoch scheiterte die Infusion allogener NK-Zellen in klinischen Studien weitgehend an der Abstoßung der Zellen durch das Wirtsimmunsystem. Um dieses Problem zu umgehen, wurden HLA-Klasse-I-Moleküle in primären NK-Zellen ausgeschaltet, um sie vor allogenen T-Zellen zu schützen. Das Abschalten von HLA-Klasse-I-Molekülen führte jedoch zu Fratrizid in den NK-Zellkulturen. Überexpression eines einkettiges HLA-E-Moleküls konnte die Zellen schützen. Die so doppelt-modifizierten NK-Zellen waren immun gegen allogene T-Zellen, unterlagen nicht dem Fratrizid und behielten dennoch ihr zytotoxisches Potenzial gegen maligne Zellen.
Die NK-Zell-Immuntherapie könnte noch effizienter sein, würden CAR-modifizierte NK-Zellen eingesetzt. Dazu wurden CD33-CAR NK-Zellen gegen AML generiert. CD33-CAR NK-Zellen aber zeigten eine geringereExpansionskapazität als Kontroll-CAR-NK-Zellen. Phänotypisierungen ergaben eine starke Hochregulation von CD33 auf bis zu 50% der kultivierten NK-Zellen, was in Kultur mit CD33-CAR-NK-Zellen zu Fratrizid führte, der die Expansion der Zellen behinderte. Nicht alle NK-Zellspender wiesen jedoch eine hohe CD33-Expression auf. Genetische Studien ergaben, dass der Einzelnukleotid-Polymorphismus (engl. SNP) rs12459419 (C>T) in Exon 2 von CD33 prädiktiv für niedrige CD33-Expressionswerte auf kultivierten NK-Zellen war. NK-Zellkulturen von homozygoten Trägern des T-Allels am SNP rs12459419 wiesen niedrige Frequenzen von CD33+ NK-Zellen auf und waren daher gut für die Produktion von CD33-CAR NK-Zellen geeignet. Außerdem zeigten CD33+ NK-Zellen eine stärkere Zytotoxizität und eine höhere Zytokinproduktion, während CD33– NK-Zellen zu stärkerer antikörperabhängiger zellulärer Zytotoxizität fähig waren.
Wir haben erfolgreich eine Genom-Editierungsplattform für primäre menschliche NK-Zellen aufgebaut und HLA-defiziente NK-Zellen für eine allogene Therapie "off-the-shelf“ erzeugt. Außerdem haben wir eine neuartige funktionelle Dichotomie von kultivierten NK-Zellen definiert, die für klinische Zwecke genutzt werden kann. Diese Ergebnisse können dazu beitragen, künftige adoptive NK-Zell-Therapieansätze für bösartige Erkrankungen mitzugestalten.Natural Killer (NK) cells are a main contributor to innate tumor-immune-surveillance in the human body. In contrast to T cells, NK cells do not cause Graft-versus-Host-Disease (GvHD) when transferred into allogeneic non-HLA-matched recipients. Therefore, NK cells appear optimally suited as universal donor cells for “off-the-shelf” immunotherapy. Yet, infusion of allogeneic NK cells largely failed in clinical trials, as the cells were rejection by the host’s immune system. To mitigate this shortcoming, HLA class I molecules in primary NK cells were knocked out to facilitate their evasion from alloreactive T cells. This knockout however led to fratricides of cultured NK cells. We therefore overexpressed a single-chain HLA-E molecule and to rescue the cells. Importantly, this double modified NK cells were shown to be immune to allogeneic T cells, were not subject to fratricide, yet still retained their cytotoxic potential against malignant cells.
NK cell immunotherapy could be even more efficient if CAR-modified NK cells were used. To this end, CD33-CAR NK cells were generated for AML. Curiously, CD33-CAR NK cell cultures showed reducedexpansion capacity compared to control CAR NK cells. Phenotypical analysis revealed a strong upregulation of CD33 on up to 50% of the cultured NK cells, which then led to fratricide upon exposure to CD33-CAR NK cells, which in turn hampered expansion of the cells. Notably, not all NK cell donors showed high CD33 expression. Genetic studies revealed that the single-nucleotide polymorphism (SNP) rs12459419 (C>T) in exon 2 of CD33 was predictive of low CD33 expression levels on cultured NK cells. NK cell cultures from homozygous carriers of the T allele at SNP rs12459419 had low frequencies of CD33+ NK cells and therefore were well suited for production of CD33-CAR NK cells. Interestingly, CD33+ NK cells harnessed stronger cytotoxicity and higher cytokine production, while CD33– NK cells exerted higher antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC).
In conclusion, we have successfully created a genome editing platform for primary human NK cells and created HLA-deficient NK cells for “off-the-shelf” allogeneic therapy. We have also defined a novel functional dichotomy of cultured NK cells which can be harnessed for clinical purposes. These results can help to guide future NK cell adoptive therapy approaches for malignancies.