Identification of Akt target proteins with relevance to the cellular radiation response
Deregulation of the phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K)-Akt pathway is involved in cancer development. Interestingly, aberrant activation of protein kinase B/Akt is associated with increased resistance to radiotherapy, as previously shown in our laboratory for activationassociated Akt mutant variants like the clinically relevant E17K. Moreover, activationassociated Akt variants were characterized by accelerated DNA double-strand break (DSB) repair kinetics. In contrast, cells with the phosphorylation-deficient Akt variants experienced slower DSB repair kinetics and were more radiosensitive. However, the underlying mechanism of Akt-dependent regulation of the radiation response impacting radioresistance is not well understood. The present study aims to identify important mechanisms and potential targets suitable to counteract Akt-mediated radioresistance.
Therefore, an unbiased approach using mass spectrometry was used to find new radiation specific Akt targets. In this analysis, various metabolic pathways and proteins were found to be downregulated 30 min after ionizing radiation (IR) in the model of TrampC1 (TrC1) Aktwildtype (WT) cells.
Further, metabolic response of TrC1 cells with activation-associated Akt-E17K, phosphorylation-deficient Akt-TASA and Akt-WT controls without or with additional pharmacological Akt inhibition to IR was analyzed using an extracellular flux assay. Here, an Akt-E17K mediated enhanced activation of mitochondrial respiration and glycolytic activity was observed at a basal state, whereas pharmacological and genetical Akt inhibition abrogated these effects. After IR-treatment, cells responded with an impairment of mitochondrial respiration and glycolysis (after 1 h) followed by a subsequential reactivation of metabolic processes (recovery, 12-24 h) which has been demonstrated also for other cancer cells within the group. Here, TrC1 Akt-E17K cells were characterized by an enhanced recovery of both, mitochondrial respiration and glycolysis after IR-treatment. Inhibition of Akt abrogated the recovery of metabolic parameters after IR. Thus, an Akt-regulated improvement of cellular metabolism might be relevant for the Akt-mediated radioresistance.
Therefore, different metabolic Akt downstream proteins were targeted with the aim to antagonize the Akt-mediated advantage after IR.
First, due to an Akt-dependent increased recovery of mitochondrial respiration after IRtreatment, the Akt-target ATP synthase which is involved in ATP production within the oxidative phosphorylation was inhibited. Interestingly, inhibition of ATP synthase with oligomycin impaired mitochondrial respiration and its recovery after IR, increased DSBs, levels of reactive oxygen species (ROS) and radiosensitized TrC1 Akt-E17K cells specifically. Thus, ATP synthase seemed to be critical for Akt-mediated radioresistance.
Second, antioxidant defense is essential after IR to counteract IR-induced ROS and is strongly connected to metabolism, e.g. via glycolysis. Further, Akt regulates the transcription of antioxidant genes via nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). Interestingly, in TrC1 Akt-E17K cells the levels of reduced glutathione (GSH) were elevated which could be counteracted by pharmacological Akt inhibition with and without radiotherapy hinting to an Aktdependent regulation of GSH.
Consequently, the increased GSH levels in TrC1 Akt-E17K cells might be another mechanism critical for radioresistance within these cells. In this context, Akt regulated proteins involved in the GSH generation, glutathione synthetase (GS) and glutathione reductase (GR), were targeted. Inhibition of GS and GR decreased GSH levels, induced ROS, cell death, and ROSdependent DSBs after IR. Finally, inhibition of GSH-mediated ROS-defense led to radiosensitization of TrC1 Akt-E17K cells.
Additionally, antioxidant defense can be fueled by nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) produced in the pentose phosphate pathway, which is dependent on glycolytic flux and the Akt target protein hexokinase 2 (HK2). Thus, inhibition of HK2 lowered levels of GSH, induced ROS and cell death, and impacted DSB repair kinetics. However, inhibition of glycolysis did not radiosensitize TrC1 Akt-E17K cells revealing compensatory mechanisms.
Third, Akt regulates acetyl-CoA production via its targets ATP citrate lyase (ACLY) or pyruvate dehydrogenase complex (PDC), thereby influencing mitochondrial respiration, lipid synthesis and histone acetylation for improved homologous recombination repair (HRR). Hence, targeting these Akt downstream proteins might decrease the metabolic response to IR as well as DSB repair capacities. Within this thesis, downregulation of ACLY or PDC decreased mitochondrial respiration, impaired HR-dependent DSB repair and radiosensitized TrC1 AktE17K cells emphasizing that acetyl-CoA production via ACLY or PDC might be critical in AktE17K-dependent cancer cells after IR.
All in all, these data reveal an important contribution of cellular metabolism to the radioresistance in Akt active TrC1 Akt-E17K cells. Moreover, different vulnerabilities of these cells were discovered to improve the radiosensitivity of TrC1 Akt-E17K cells by targeting mitochondrial metabolism, antioxidant defense or acetyl-CoA generation.
Eine Deregulierung des Phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K)-Akt Signalwegs kann zur Krebsentstehung führen. Vorherige Arbeiten aus der Arbeitsgruppe zeigten, dass eine abnormale Aktivierung der Proteinkinase B/Akt mit einer erhöhten Strahlenresistenz und beschleunigter DNA-Doppelstrangbruchreparatur (DSB-Reparatur) verbunden ist, z.B. in TrampC1 murinen Prostatakrebszellen (TrC1) mit der klinisch relevanten aktiven AKT-E17K Mutante. Dahingegen waren Zellen mit einer Akt Variante ohne Phosphorylierungsaktivität durch eine langsamere DSB-Reparatur und eine höhere Stahlensensitivität charakterisiert. Um die zugrundeliegenden Mechanismen einer Akt-regulierten Strahlenresistenz besser verstehen zu können, sollten wichtige Mechanismen und geeignete Zielproteine identifiziert werden, um der Akt-regulierten Strahlenresistenz entgegenzuwirken.
Dazu sollten mit Hilfe von Massenspektrometrie neue strahlenspezifische Akt Zielproteine gefunden werden. In diese Analyse wurden verschiedene metabolische Signalwege und Proteine gefunden, die 30 min nach Bestrahlungsbehandlung in den TrC1 Akt-Wildtyp (WT) Zellen runterreguliert waren.
Des Weiteren wurden die TrC1 Zellen mit aktiven AKT-E17K Mutante, phosphorylierungsdefizienten Akt-TASA Variante und Akt-WT mit zusätzlicher pharmakologischer Akt Inhibierung mit Hinblick auf ihre metabolische Antwort auf Bestrahlung analysiert. In einem unbestrahlten Zustand konnte eine erhöhte mitochondriale Zellatmung und Glykolyse in den TrC1 Akt-E17K mutierten Zellen beobachtet werden, wobei eine pharmakologische oder genetische Inhibierung von Akt dem entgegenwirkte. 1 h nach Bestrahlung der Zellen wurde eine Verringerung der metabolischen Aktivität in den Zellen beobachtet, gefolgt von einem Wiederanstieg in der Erholungsphase (12-24 h). Ähnliche Beobachtungen wurden auch schon vorher in der Arbeitsgruppe in anderen Krebszelllinien entdeckt. Interessanterweise war der Wiederanstieg der metabolischen Aktivität in den TrC1 Akt-E17K Zellen verbessert, wogegen eine Inhibierung von Akt den Wiederanstieg beeinträchtigte. Daraus lässt sich schließen, dass die Akt-regulierte Verbesserung der metabolischen Signalwege relevant für die Akt-regulierte Strahlenresistenz sein könnte.
Um dem Akt-geschuldeten Vorteil entgegenzuwirken, wurden verschiedene metabolische Zielproteine von Akt gehemmt.
Als erstes wurde das Akt Zielprotein ATP Synthase aus der oxidativen Phosphorylierung gehemmt, um die Akt-regulierte erhöhte mitochondriale Zellatmung nach Bestrahlung zu vermindern. ATP Synthase Inhibierung mit Oligomycin reduzierte die mitochondriale Zellatmung und dessen Wiederaktivierung nach Bestrahlung, erhöhte die Doppelstrangbrüche und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sowie die Strahlensensitivität speziell in TrC1 Akt-E17K Zellen und ist daher kritische für die Akt-geschuldete Strahlenresistenz.
Ein anderer, essenzieller Aspekt in der Strahlenantwort ist das zelluläre Antioxidans-System, welches ROS entgegenwirkt und stark mit metabolischen Prozessen wie z.B. der Glykolyse verbunden ist. Akt reguliert die Transkription verschiedener Antioxidans-Gene durch den nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). Außerdem waren die Level des reduzierten Glutathions (GSH) in den TrC1 Akt-E17K Zellen in einem unbestrahlten und bestrahlten Zustand erhöht, wobei Akt Inhibierung diese verminderte, was auf eine Regulierung über Akt deutet.
Da eine erhöhte Aktivierung von GSH ein möglicher Mechanismus in der Akt-regulierten Strahlenresistenz sein könnte, wurde die GSH Generierung über die Glutathionsynthase (GS) und Glutathionreduktase (GR) gehemmt. Das führte zu einer Reduktion der GSH Level, Erhöhung von ROS, Zelltod, ROS-induzierten Doppelstrangbrüchen nach Bestrahlung und final zu einer Radiosensitivierung von TrC1 Akt-E17K Zellen.
Zusätzlich hängt die Produktion von Antioxidantien von dem im Pentose Phosphatweg generierten Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH) ab, was durch die Glykolyse und dem Akt Zielprotein Hexokinase 2 (HK2) beeinflusst wird. Hemmung der HK2 erniedrigte GSH Level, induzierte ROS und Zelltod und veränderte die DSB-Reparaturkinetik. Allerdings führte die Inhibierung von HK2 nicht zur Radiosensitivierung von TrC1 Akt-E17K Zellen, was auf kompensatorische Mechanismen hinweist.
Akt beeinflusst die mitochondriale Zellatmung, Lipidsynthese und Histon-Acetylierung, welche für die homologe Rekombinationsreparatur (HRR) wichtig ist, über die Acetyl-CoAgenerierenden Zielproteine ATP-Citrat-Lyase (ACLY) oder Pyruvatdehydrogenase-Komplex (PDC). Eine Inhibierung dieser Zielproteine könnte eine parallele Verminderung der metabolischen Prozesse und DSB-Reparatur zufolge haben. Eine Runterregulation von ACLY und PDC reduzierte die mitochondriale Zellatmung, HRR und führte zu einer Radiosensitivierung von TrC1 Akt-E17K Zellen, was die Wichtigkeit der Acetyl-CoA Produktion über ACLY oder PDC in der Strahlenantwort von Akt-E17K-abhängigen Krebszellen betont.
Abschließend konnten die zugrunde gelegten Ergebnisse die Wichtigkeit des zellulären Metabolismus für die Strahlenresistenz der TrC1 Akt-E17K Zellen zeigen. Außerdem wurden verschiedene Zielproteine des mitochondrialen Metabolismus, des Antioxidans-Systems und der Acetyl-CoA Generierung zum Erreichen einer erhöhten Strahlensensitivität der TrC1 AktE17K Zellen gefunden.