Multivalente Pinzetten zur Erkennung von Poren, Schleifen und Flanken auf Proteinoberflächen
Die molekulare Diphosphatpinzette wird als Werkzeug zur selektiven Bindung an bestimmte Aminosäuren wie Lysine und Arginine genutzt. Durch dessen aromatischen Gerüst kann es die Seitenkette in seine Kavität durchfädeln und mit der negativen Ladung der Phosphatgruppe mit dem positiv geladenen Ammonium-/Guanidinköpfchen wechselwirken. Diese Interaktion kann Funktionen von Proteinen beeinflussen und ist daher interessant für die Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen (PPI) wie z.B. von Segregase p97, welches für den Entfaltungsprozess von Proteinen zuständig ist. In diesem Falle spielt die dynamische Funktion der Pore im Zentrum der zwei ATPase Domänen D1 und D2 von p97 eine wichtige Rolle und weckte deshalb unser Interesse. Neben p97 können Proteine mit lysinreichen Bereichen wie die Protease Taspase 1 oder Mikrotubuli-bindende Element vom Kinetochor Ndc80 auch durch multivalente Pinzetten angesteuert werden.
Dazu wurde in dieser Arbeit symmetrische und unsymmetrische multivalente Pinzetten mit definierten Abständen und verschiedenen zentralen aromatischen Kerngerüsten hergestellt und über Click Reaktion kovalent gebunden, sodass Aminosäuren an der Porengrenze oder lysinreiche Bereiche auf Proteinen angesteuert werden konnten. Diese Hybidpinzetten erhöhen die Bindungsaffinität zum Protein durch erhöhte Anzahl bindender Elemente. Durch verschiedene Experimente wie Entfaltungsassay, ITC, Pulldown Assay, NMR- und Fluoreszenz Titration wurden diese Moleküle an Proteinen getestet. Somit konnte bestimmt werden, welche der multivalenten Pinzetten für die unterschiedlichen Proteinen am besten genutzt werden kann.
Molecular diphosphate tweezers are tools to selectively target certain amino acids, e.g., lysine and arginine. The aromatic scaffold demonstrates the capability of hosting the side chain in the cavity and the negatively charged phosphates interact to the positively charged functional groups. This interaction may inhibit the function of proteins and can be employed in the investigation of protein-protein-interaction (PPI) e.g. that of segregase p97 which is relevant for unfolding of proteins. In this regard, the dynamic function of the pore in the center of the two ATPase domains, D1 and D2, of the protein, appears to play an important role and thereby raised our interest. However, other proteins with lysine-rich areas such as the oncologically relevant protease Taspase1 or microtubule-binding element of the kinetochore, the Ndc80 complex, can also be targeted by these multivalent molecular tweezers.
Therefore, in this work symmetric as well as asymmetric multivalent tweezers with defined distances and different types of core units containing aromatic systems were synthesized through click reactions to target the amino acids on the border of the pore or lysine-rich areas. This tailored hybrid tweezers increased the affinity towards the protein since multiple sites of the proteins interact simultaneously to induce stronger bindings. All novel tweezer molecules were analyzed by several experiments such as unfolding assay, ITC, pulldown assay, NMR and fluorescence titration. By these experiments it was determined, which multivalent tweezer is best suited for various proteins.