Functional characterization of the E3 ligase ITCH in the cellular response to lysosomal damage
Lysosomen sind die wichtigsten Organellen für zelluläre Abbauprozesse und zentrale Regulatoren der Zellhomöostase. Die lysosomale Membran kann durch eine Vielzahl von Faktoren permeabilisiert werden (lysosomal membrane permeabilization, LMP), wodurch die lysosomale Funktion verloren geht, Entzündungsprozesse ausgelöst werden und letztendlich der Zelltod eingeleitet wird. Permeabilisierte Lysosomen werden durch die endolysosomale Schadensantwort (endo-lysosomal damage response, ELDR) erkannt und durch selektive Autophagie, die dann als Lysophagie bezeichnet wird, beseitigt. Lysophagie wird durch eine umfangreiche Ubiquitinierung der Lysosomen ausgelöst, wobei die dafür relevante Ubiquitinierungsmaschinerie weitgehend unverstanden ist.
In dieser Arbeit wurde ein mikroskopiebasiertes Lokalisations-Screening der Nedd4- Unterfamilie der E3-Ligase-Enzyme durchgeführt. Dabei wurden Kandidaten für E3- Ligasen identifiziert, die in der Lysophagie nach chemisch induziertem Schaden eine Rolle spielen. Als ein Kandidat wurde die E3-Ligase ITCH gefunden, deren siRNAvermittelte Depletion zu einer Reduktion der Gesamtubiquitinierung der Lysosomen führte, wobei vor allem K63-verknüpfte Ubiquitinketten betroffen waren. Außerdem führte der Knockdown von ITCH zu einer beeinträchtigten Rekrutierung des Autophagierezeptors p62 zu den beschädigten Lysosomen. Dies korrelierte mit der beeinträchtigten Rekrutierung von LC3-positiven Isoliermembranen (isolation membranes), die für die Initiation der Autophagie erforderlich sind. Eine zentrale Erkenntnis dieser Arbeit ist, dass der Knockdown von ITCH zu einer Verzögerung bei der Beseitigung von beschädigten Lysosomen mittels Autophagie führt. Weiterhin konnten die Effekte der siRNA-vermittelten Depletion von ITCH in ITCH-KnockoutZellen bestätigt werden. Dies bekräftigt die zentrale Rolle von ITCH in der endolysosomalen Schadensantwort und unterstreicht die Bedeutung der lysosomalen Ubiquitinierung für erfolgreiche Lysophagie. Zudem konnte in einer Proteomanalyse gezeigt werden, dass – nach lysosomalem Schaden – die meisten Substratkandidaten von ITCH bekannte Komponenten der endolysosomalen Schadensantwort sind und mit der für ITCH postulierten Rolle übereinstimmen. Zusammengenommen konnte in dieser Arbeit ein zentrales regulatorisches Enzym der zellulären Antwort auf lysosomale Membranpermeabilisation identifiziert werden, wodurch weitere physiologische und pathophysiologische Analysen dieses Signalwegs ermöglicht werden.
Lysosomes are the major organelles for degradation and crucial regulators of cellular homeostasis. A large number of conditions can lead to lysosomal membrane permeabilization (LMP), resulting in loss of lysosomal function, inflammation and cell death. Permeabilized lysosomes are detected by the Endo-Lysosomal Damage Response (ELDR) and cleared by selective autophagy, termed lysophagy. Lysophagy is triggered by extensive ubiquitination of the lysosome, but the critical ubiquitination machinery is only partially characterized.
In this study, we conducted a microscopy-based lysosome localization screen of the Nedd4 subfamily of E3 ligase enzymes after chemically-induced damage, to identify E3 ligase candidates involved in lysophagy. ITCH E3 ligase was found as a candidate. Importantly, siRNA-mediated depletion of ITCH led to reduction of overall lysosome ubiquitination that affected, mainly, K63-linked ubiquitination. Consistent with that, ITCH knockdown led to impaired recruitment of the autophagy receptor p62 to damaged lysosomes, which, in turn, correlated with the compromised recruitment of LC3-positive isolation membranes required for autophagy initiation. Crucially, ITCH knockdown led to a delayed autophagic clearance of damaged lysosomes from the cell. Of note, the effects of siRNA-mediated depletion of ITCH were confirmed in ITCH knockout cells, providing evidence for the key role of ITCH in ELDR and underscoring the importance of lysosomal ubiquitination for effective lysophagy. Moreover, a proteomic analysis revealed that, upon damage, most candidate substrates of ITCH are known elements of ELDR and concur with the proposed role for ITCH.
Thus, this work identified a central regulatory enzyme in the response to LMP and opens the way to further elucidate the pathway in physiological and pathophysiological contexts.