Synthese von Zinkoxid-, Titandioxid- und Silica-Partikeln mit definierter Form, Größe und Kristallinität und ihre zellbiologischen Effekte

In this work the synthesis and characterization of various oxide particle systems was presented. These systems were further tested on lung macrophages (NR8383) towards toxicological effects. Five different oxide particle systems were chosen as model particles for toxicological studies. These were SiO2 (amorphous silica and quartz), ZnO and TiO2 (anatase and rutile). For particle synthesis, various wet chemical methods were performed, with the goal to produce monodisperse and colloidally stabile particles in a reproducible way. The focus of these syntheses was to obtain chemically identical particles, which differed in size, shape and crystallinity. Thus enabled a comparative study of the influence of these particle parameters on cell viability. In the synthesis of all oxide particle systems, three particle size ranges (nano, submicro and micrometer) and two particle shapes (spheres and rods) were obtained. Depending on the type of synthesis, the particles were electrostatically- or sterically-stabilized and tested for purity, shape, and chemical and crystallographic composition using various methods, including colloid-chemical, electron microscopic, spectroscopic and crystallographic methods.
In the first part of the thesis, the Stöber process resulted in preparing "naked" (non-functionalized) silica spheres with three particle sizes, through targeted hydrolysis and subsequent polycondensation of tetraethylorthosilicate (TEOS). The particle size and shape of silica spheres could be controlled by the concentration of starting materials and reaction temperature. For the synthesis of silica nanospheres and submicrospheres the temperature was increased accordingly. Since only spherical amorphous silica particles were obtained, according to the classic Stöber method, further addition of a cationic surfactant (CTAB) to the reaction mixture was necessary to obtain a directed anisotropic growth of the particles. After a slight modification of the literature-known protocols, CTAB-functionalized silica submicrorods and microrods were successfully synthesized. The control of particle length during synthesis could be achieved through the molar ratio of reactants and by adjustment of the stirring speed. However, with the modified Stöber process, it was not possible to obtain CTAB-silica nanorods with an average particle length of ≤100 nm. Since CTAB is cytotoxic, and thus CTAB-functionalized silica rods were unsuitable for further biological studies, a strategy to remove CTAB from the particles was developed. “Naked” (CTAB-free) silica rods obtained in this way were examined for the presence of CTAB on their surface by IR spectroscopy and elemental analysis. Furthermore, the DLS measurements confirmed that the particles were electrostatically stabile as in the case of amorphous silica spheres. An additional type of rod-shaped silica particles could be produced based on the microemulsion method. In the presence of PVP, in a water-oil emulsion (1-pentanol / water mixture), a directional growth of polymer-functionalized silica large rods (with an average particle length of 3.5 μm) could be achieved. After fluorescence labelling of 6 types of the silica particles, with dye-coupled polymers (CMC-F or PEI-FITC), the cellular uptake of the particles could be followed by confocal laser scanning microscopy (CLSM).
In contrast to amorphous silica particles, which were easily obtained in the sol-gel process using the Stöber method, the synthesis of monodisperse quartz particles with defined shape and size could not be guaranteed, due to lack of dispersibility and loss of the original morphology after crystallization. By using common solid-state chemistry methods, such as hydrothermal syntheses or high-temperature processes, it was possible to convert the amorphous silica particles to quartz particles or cristobalite particles, however, they demonstrated a tendency to form larger crystalline SiO2 particles. Internal crystallization of the quartz particles from amorphous silica particles was therefore not possible without changing the original particle shape.
In the next part of the thesis, PVP-ZnO particles in wurtzite structure were successfully synthesized from zinc salts and in the presence of PVP in two one-pot syntheses. These were performed in dimethylformamide (DMF) and in polyols (polyol process). Although synthesis of the PVP-ZnO nanospheres and PVP-ZnO nanorods was carried out as described in literature, an optimization of synthesis was already needed to obtain PVP-ZnO microspheres and PVP-ZnO microrods with defined parameters. Our own investigations on the influence of reaction parameters on particle properties in DMF one-pot synthesis demonstrated that the amount of water in the reaction mixture was critical to control shape of the particles. On the other hand, shortening of the reaction time enabled to control particle size with unchanged reaction conditions and led to successful synthesis of PVP-ZnO submicrospheres. In-depth studies indicated that a change in the amounts of zinc salt and water, in the polyol process, did not result in formation of PVP functionalized ZnO submicrorods.
The quantitative analysis of the release of Zn2+ ions from the five types of PVP-ZnO particles was investigated in different environments, i.e., ultrapure water, RPMI medium and simulated lysosomal medium. Contrary to the expectations, no significant differences in the release of Zn2+ ions in ultrapure water and biological media, correlated with size and shape of the particles, were found. Hypothetically, the increased surface area of ZnO nanoparticles, compared to submicro- and microparticles, should lead to a significantly higher release of Zn2+ ions. Overall, the dissolution of ZnO particles in biological media was higher (up to 17%) than in ultrapure water (up to 7%). As expected, dissolution studies in the simulated lysosomal medium confirmed that ZnO particles were almost completely dissolved after 1 hour of incubation in the acidic medium (pH <5).
The last aim of the thesis was to synthesize TiO2 particles in two different polymorphic forms: anatase and rutile. Although, TiO2 particles may exist in three crystallographic modifications: anatase, rutile and brookite, they can also be produced in an amorphous form or with mixed crystalline phases in a wet-chemical method. Control of the three target particle sizes, two particle shapes (spheres and rods) and two crystal structures (anatase and rutile) led to synthesis of twelve different types of TiO2 particles. Many, however, not all, types of TiO2 particles could be synthesized in this work. Results of this work show that synthesis of spherical anatase particles (in three target sizes) was possible, in contrary to anatase rods. After the sol-gel process, amorphous “naked” submicrospheres and microspheres could be obtained from titanium alcoholates. Next, they were crystallized to anatase by calcination at 500 ˚C for 1 h, without losing their shape and colloidal stability. On the other hand, preparation of significantly smaller crystalline anatase nanospheres required harsher reaction conditions and was carried out by converting titanium alcoholates in concentrated acetic acid at 200 ˚C in the solvothermal synthesis. Using the polyol method, it was possible to synthesize amorphous TiO2 large rods which, analogous to PVP silica large rods, were very promising as model particles for potential toxicological studies on fibrous particles (WHO-fibres).
The presence of chloride ions in the reaction mixture was critical for the formation of rutile particles with defined shape and crystal structure. Based on the modifications of well-known syntheses of rutile particles, it was possible to show that the formation of rutile nanorods from titanium alcoholates in aqueous hydrochloric acid was possible within 24 h at room temperature. Interestingly, conversion of the same reactants under hydrothermal conditions favored the growth of rutile particles. This resulted in the formation of rutile submicrorods at 200 ˚C already after 2 hours. A further increase in the reaction time from 2 hours to 24 hours, with the same reaction conditions, did not enhance the growth of rutile microrods. Another Modification of the well-known procedure for synthesis of rutile particles led to the production of rutile microspheres. The particles were synthesized with the addition of HCl to the hydrolyzed solution of TiCl4 followed by subsequent hydrothermal synthesis at 100 ˚C for 24 h. Obtained rutile particles were generally spherical and crystallographically consisted of rod-like rutile nanocrystallites assembled to form the microspheres. Compared to rutile microspheres, the anatase microspheres were composed of spherical nanocrystallites.

Die vorliegende Arbeit umfasst die Synthese und Charakterisierung von verschiedenen Oxid-Partikelsystemen, deren toxikologische Beurteilung an den Lungenmakrophagen (NR8383) systematisch untersucht werden sollte. Als Modellpartikel für toxikologische Studien wurden fünf verschiedene Oxid-Partikelsysteme gewählt (SiO2: amorphes Silica und Quarz, ZnO, TiO2: Anatas und Rutil). Zur Partikelsynthese wurden verschiedene nasschemische Synthesestrategien ausgearbeitet, mit dem Ziel, reproduzierbar monodisperse und kolloidal stabile Partikel herzustellen. Der Fokus dieser Synthesen lag weiterhin auf der Gewinnung definierter Partikel, die sich bei einer chemisch gleichen Zusammensetzung und ggf. Kristallinität, nur in ihren Größen und Formen unterschieden, und somit eine vergleichende toxikologische Beurteilung der Einflüsse dieser Parameter innerhalb der jeweiligen Partikelsysteme ermöglichen. Erzielt wurden bei den Synthesen aller Oxid-Partikelsysteme drei Partikelgrößenbereiche (Nano-, Submikro- und Mikrometerbereich) und zwei Partikelformen (Kugeln, Stäbchen). Je nach Art der Synthese waren die Partikel elektrostatisch oder sterisch stabilisiert und hinsichtlich ihrer Reinheit, Partikelform, chemischer und kristallographischer Zusammensetzung mittels verschiedener Methoden geprüft.
Im ersten Teil der Arbeit gelang es im Stöber-Prozess durch gezielte Hydrolyse und anschließende Polykondensation des Tetraethylorthosilicat (TEOS), “nackte“ (nicht funktionalisierte) Silica-Kugeln mit drei gewünschten  Partikelgrößen präparativ darzustellen. Die Partikelgröße und die kugelförmige Form der Silica-Kugeln ließen sich dabei über die Konzentration der eingesetzten Edukte sowie über die Reaktionstemperatur einstellen, wobei für die Synthese der Silica-Nanokugeln und Submikrokugeln die Temperatur entsprechend erhöht wurde. Da nach der klassischen Stöber-Methode lediglich kugelförmige, amorphe Silica-Kugeln gewonnen werden, war ein weiterer Zusatz eines kationischen Tensids (CTAB) ins Reaktionsgemisch erforderlich, um ein gerichtetes anisotropes Wachstum der SilicaStäbchen zu erzielen. Durch eine leichte Modifizierung der literaturbekannten Versuchsvorschrift konnten CTAB-funktionalisierte Silica-Submikrostäbchen und CTAB-funktionalisierte Mikrostäbchen erfolgreich synthetisiert werden. Die Kontrolle der Partikellängen während der Synthesen konnte durch das molare Verhältnis der Reaktanden zueinander sowie über die angepasste Rührgeschwindigkeit der Reaktionsmischung erreicht werden. Mit diesem modifizierten Stöber-Prozess gelang es allerdings nicht,
CTAB-Silica-Nanostäbchen mit durchschnittlichen Partikellängen ≤100 nm zu erhalten. Da CTAB zytotoxisch ist und damit auch CTAB-Silica-Stäbchen für weitere biologische Studien ungeeignet macht, wurde im Verlauf der Arbeit eine Strategie ausgearbeitet, um verbleibendes CTAB aus den Partikeln zu entfernen. Die auf diese Weise gewonnenen, “nackten“ (nicht funktionalisierte, CTAB-freie) Silica-Stäbchen wurden folglich auf die Abwesenheit von CTAB auf ihrer Oberfläche mittels IR-Spektroskopie und Elementaranalyse untersucht.
Darüber hinaus bestätigten die DLS-Messungen, dass die beiden Silica-Stäbchensorten wie im Fall von amorphen Silica-Kugeln elektrostatisch stabil waren. Ergänzend zum Projekt konnte dennoch eine weitere stäbchenförmige Silica-Partikelsorte mittels der Mikroemulsion-Technik dargestellt werden. In Gegenwart von PVP-Polymer konnte in der Wasser-Öl-Emulsion (1-Pentanol/Wasser) ein gerichtetes Wachstum von Polymer-funktionalisierten
Silica-Riesenstäbchen (mit einer durchschnittlichen Partikellänge von 3,5 µm) erreicht werden. Nach der Fluoreszenzmarkierung von insgesamt sechs Silica-Partikelsorten mit Farbstoff-Polymeren (CMC-F oder PEI-FITC) konnte die zelluläre Aufnahme der Partikel mithilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) verfolgt werden. Im Gegensatz zu amorphen Silica-Partikeln, die nach dem Sol-Gel-Prozess mittels Stöber-Prozess leicht erhalten werden konnten, war die Darstellung monodisperser Quarz-Partikel mit definierter Form und Größe aufgrund mangelnder Dispergierbarkeit in Reinstwasser und Verlust der ursprünglichen Morphologie nach Kristallisation schlecht realisierbar. Mit den gängigen Methoden der Festkörperchemie, wie z.B. Hydrothermalsynthesen oder Hochtemperaturprozessen, konnten die amorphen Silica-Partikel in Quarz- oder Cristobalit-Partikel umgewandelt werden, zeigten jedoch eine Tendenz zur Bildung größerer kristalliner Siliciumdioxid-Partikel. Somit war eine interne Kristallisation der Quarz-Partikel aus amorphen Silica-Partikeln ohne Veränderung der ursprünglichen Partikelform nicht möglich.
Im nächsten Teil der Arbeit konnten erfolgreich PVP-ZnO-Partikel in der Wurtzit-Struktur ausgehend von Zinksalzen und in Gegenwart von PVP mit zwei verschiedenen “Eintopfsynthesen“: in Dimethylformamid (DMF) und in Polyolen (Polyol-Prozess) hergestellt werden. Während die Darstellung der PVP-ZnO-Nanokugeln und PVP-ZnO-Nanostäbchen exakt nach den literaturbekannten Versuchsvorschriften erfolgte, mussten zur Darstellung der
PVP-funktionalisierten ZnO-Mikrokugeln und ZnO-Mikrostäbchen weitere Optimierungen der literaturorientierten Synthesen vorgenommen werden, um die Partikel mit monodisperser Partikelgrößenverteilung bzw. in gewünschter Form zu gewinnen. Eigene Untersuchungen der Einflüsse der Reaktionsparameter auf die Partikeleigenschaften bei den DMF-Eintopfsynthesen zeigten, dass vor allem die Wasser-Menge im Reaktionsgemisch den größten Effekt zur Kontrolle der Partikelform ausübt. Eine entsprechende Verkürzung der Reaktionsdauer ermöglichte hingegen eine Kontrolle über die Partikelgröße bei ansonsten gleichbleibenden
Reaktionsbedingungen und schließlich die erfolgreiche Synthese von
PVP-funktionalisierten ZnO-Submikrokugeln. Eingehende Studien zeigten wiederum, dass eine Änderung der Zinksalz- und Wassermengen in den durchgeführten Modifikationen der Polyol-Synthese nicht zur Bildung von PVP-funktionalisierten ZnO-Submikrostäbchen führte.
Die quantitative Analyse der Freisetzung von Zn2+-Ionen aus erfolgreich hergestellten fünf PVP-ZnO-Partikelsorten wurde in unterschiedlichen Medien, wie z.B. im Reinstwasser, RPMI-Medium und in simulierten lysosomalen Medien untersucht. Entgegen den Erwartungen wurden keine signifikanten Unterschiede in der Freisetzung der Zn2+-Ionen im Reinstwasser und im biologischen Medium festgestellt, die auf morphologisch bedingte und größenabhängige Korrelation dieser Partikel zurückzuführen wären. Hypothetisch sollte die vergrößerte Oberfläche von ZnO-Nanopartikeln im Vergleich zu den Submikro- und Mikropartikeln in deutlich höherer Auflösung hin zu Zn2+-Ionen resultieren. Insgesamt jedoch war die Auflösung der ZnO-Partikel in biologischem Medium tendenziell größer (bis zu 17%) als in Reinstwasser (bis zu 7%). Erwartungsgemäß bestätigten die Auflösungsstudien in simulierten lysosomalen Medien, dass die ZnO-Partikel bereits nach 1 h Inkubation in sauren Medien (pH <5) fast komplett aufgelöst werden.
Die letzte Aufgabenstellung der Arbeit lag in der Synthese von TiO2-Partikeln in zwei verschiedenen Kristallstrukturen: Anatas und Rutil. TiO2-Partikel kommen in den drei Hauptmodifikationen vor: Anatas, Rutil, Brookit, lassen sich allerdings nasschemisch auch in amorpher Form oder als Mischphasen dreier kristalliner Phasen herstellen. Bei der Kontrolle der drei angestrebten Partikelgrößen, zwei Partikelformen (Kugeln und Rutil) und der beiden
Kristallstrukturen ergaben sich somit insgesamt zwölf verschiedene TiO2-Partikelsorten. Viele, jedoch nicht alle TiO2-Partikelsorten konnten im Rahmen dieser Arbeit präparativ gewonnen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Darstellung der kugelförmigen Anatas-Partikel für die drei angestrebten Partikelgrößen präparativ wesentlich zugänglicher ist als für Anatas-Stäbchen. Nach dem Sol-Gel-Prozess konnten ausgehend von Ti-Alkoholaten zunächst amorphe, “nackte“ Submikro- und Mikrokugeln gewonnen werden, die anschließend durch Kalzinierung bei 500 ˚C für 1 h in der Anatas-Phase auskristallisierten, ohne dabei ihre äußere Partikelform oder kolloidale Stabilität zu verlieren. Die präparative Darstellung der deutlich kleineren, direkt kristallinen Anatas-Nanokugeln benötigte hingegen deutlich härtere Reaktionsbedingungen, und erfolgte durch die Umsetzung der Ti-Alkoholate in konzentrierter Essigsäure bei 200 ˚C mittels der Solvothermalsynthese. Nach dem Polyol-Prozess gelang es hingegen amorphe TiO2-Riesenstäbchen zu synthetisierten, die analog zu den PVP-Silica-Riesenstäbchen, ein weiteres und interessantes Modellpartikel für
potenzielle toxikologische Untersuchungen an länglichen "WHO-Fasern" vielversprechend waren.
Maßgeblich für die Bildung der Rutil-Partikel in definierter Partikelform und Kristallstruktur war die Anwesenheit der Chlorid-Ionen im Reaktionsgemisch. Anhand der Modifikationen bekannter Synthesen von Rutil-Partikeln konnte gezeigt werden, dass die Bildung von Rutil-Nanostäbchen aus Ti-Alkoholaten in wässriger Salzsäure innerhalb von 24 h bei Raumtemperatur möglich war. Interessanterweise begünstigte die Umwandlung der gleichen Reaktanten unter hydrothermalen Bedingungen das Wachstum von Rutil-Partikeln. Dies führte bereits nach 2 h zur Bildung von Rutil-Submikrostäbchen bei 200 ˚C. Eine weitere Erhöhung der Reaktionszeit von 2 h auf 24 h, unter ansonsten gleichen Reaktionsparametern, ermöglichte allerdings keine Gewinnung von reinen Rutil-Mikrostäbchen. Eine weitere Modifizierung der literaturbekannten Synthese ermöglichte hingegen die Darstellung der Rutil-Mikrokugeln. Die
Partikel wurden durch Zugabe von HCl zu der hydrolysierten Lösung von TiCl4, gefolgt von der Hydrothermalsynthese bei 100 ˚C für 24 h, synthetisiert. Die erhaltenen Rutil-Partikel wiesen annähernd sphärische Morphologie auf und bestanden aus deutlich kleineren, stäbchenartigen Rutil-Nanokristalliten, die zu Mikrokugeln zusammengelagert waren. Im Vergleich zu Rutil-Mikrokugeln waren die Anatas-Mikrokugeln aus kugelförmigen Nanokristalliten aufgebaut


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