Cytokine networks engaging the Jak-Stat-pathway: implications for acute-on-chronic liver failure
Liver cirrhosis is the leading cause for liver-related deaths and may progress to development of ACLF. Cirrhosis-related immune dysfunction is well described in the literature as well as systemic inflammation that aggravates towards ACLF. Elevated levels of pro- and anti-inflammatory cytokines in these patients mirror this development. However, little is known about the interplay between the different upregulated cytokines and a deeper understanding is necessary to evaluate and improve immunotherapies.
The presented work aims to elucidate the interdependence of chosen cytokines, especially IL-6, IL-22 and IFNγ, in hepatocytes and PBMCs of patients suffering from different stages of liver cirrhosis and ACLF. Our results show that cytokines using the same signalling pathway often influence each other’s signalling. In particular, the combination of IL-6 and IL-22 synergistically enhances short-term phosphorylation of Stat1 and Stat3 and supports anti-microbial effects by enhancing LBP RNA expression. However, IL-6 and IFNγ show antagonistic effects regarding TIMP-1 and IRF1 RNA expression. Furthermore, hepatocytes show refractoriness upon repetitive cytokine stimulation which is dependent on the respective cytokine. Though, refractoriness is not based on a general unresponsiveness of Stat phosphorylation itself as it is still inducible by stimulation with another cytokine that used the same Stat signalling molecules as seen for IL-6 and IL-22. Upon cytokine withdrawal, Stat phosphorylation could be reinduced earlier upon repetitive cytokine stimulation compared to hepatocytes that were continuously exposed to the cytokine. Results from multicolour flow cytometry experiments revealed a dysfunctional IL-6-Stat3 pathway in liver cirrhosis patients that aggravates during the course of disease shown by strongly impaired Stat3 phosphorylation, especially in patients with acute decompensation. Additionally, CD4+ and CD8+ T cell subpopulations become refractory upon repetitive cytokine stimulation with IL-6. A preactivation of the Stat3 signalling pathway was predominantly observed in monocytes but also in T cells.
The results show synergistic and antagonistic interdependences between cytokines which are described as upregulated in the context of liver cirrhosis and ACLF. Continuous stimulation leads to ineffective activation of the IL-6/IL-22-Stat3 signalling axis in hepatocytes and T cells from patients in different states of liver cirrhosis. This might contribute to worsened liver regeneration capacity and increased risk of infection in those patients.
Future experimental approaches should consider the order of administration in combination cytokine therapies as it was shown to be possible to decouple toxicity from efficacy in syngeneic mouse tumour models (IL-2 and IFNα). Functional consequences in PBMCs need to be elaborated. Establishing an animal model that mimics liver cirrhosis and ACLF from patients is a good opportunity to confirm and further investigate the presented findings in vivo. It is of further interest how cytokine combinations affect other cells or tissues such as the gastrointestinal barrier function that is described to be strengthened by IL-22.
Die Leberzirrhose ist der häufigste Grund für Leber-assoziierte Todesfälle. Eine Verschlechterung der Krankheit kann zur Entwicklung eines akut-auf-chronischen Leberversagens (ACLV) führen. Assoziiert mit Leberzirrhose und ACLV sind sowohl immunologische Dysfunktion als auch systemische Inflammation in den Patienten. Diese Symptome verschlechtern sich in Richtung eines ACLV. Zusätzlich sind erhöhte pro- und anti-inflammatorische Zytokinlevel beschrieben, wobei eine direkte Beziehung zwischen der Höhe der Zytokinlevel und dem Krankheitsfortschritt von Leberzirrhose zu ACLV gezeigt werden konnte. Ein besseres Verständnis der Bedeutung der Zytokine in der Krankheitspathogenese ist insbesondere im Hinblick auf ihre therapeutische Nutzbarkeit und ihr Manipulationspotential von großer Bedeutung
In der vorliegenden Arbeit sollen die Wechselwirkungen von ausgewählten Zytokinen, besonders von IL-6, IL-22 und IFNγ, in Hepatozyten und Patienten in verschiedenen Stadien der Leberzirrhose und des ACLV untersucht werden. Die dargestellten Ergebnisse zeigen, dass sich die Zytokine, welche denselben Signalweg bedienen, gegenseitig in ihrem Antwortverhalten beeinflussen. Im Besonderen die Kombination aus IL-6 und IL-22 zeigt einen Synergismus, welcher die kurzzeitige Phosphorylierung von Stat1 und Stat3 verstärkt und die Expression von anti-mikrobieller LBP RNA erhöht. Dahingegen zeigt die Kombination von IL-6 und IFNγ antagonistische Effekte auf die vom jeweils anderen Zytokin induzierte Signalantwort, wenn die Expression von TIMP-1 und IRF1 RNA betrachtet wird. Außerdem konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Hepatozyten nach wiederholter Zytokinstimulation und abhängig vom jeweiligen Zytokin refraktär werden. Die verminderte Reaktivität gegenüber einem wiederholten Zytokinstimulus, zum Beispiel IL-6, basiert dabei nicht auf einer generellen Dysfunktion des StatSignalwegs selbst, da dieser durch Stimulation mit einem anderen Zytokin, zum Beispiel IL-22, erneut aktiviert werden konnte. Wenn das entsprechende Zytokin dem Medium der Hepatozyten zwischen den Stimulationszeitpunkten entzogen wurde und die Hepatozyten dem Zytokin nicht dauerhaft ausgesetzt wurden, konnte eine schnellere Reaktivierung des Stat-Signalwegs erreicht werden im Vergleich zur dauerhaften Stimulation. Die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analysen zeigen einen gestörten IL-6-Stat3-Signalweg in Patienten mit Leberzirrhose. Diese Störung verstärkt sich im Verlauf der Erkrankung, was durch stark verminderte Stat3- Phosphorylierung besonders in Patienten mit einer akut dekompensierten Zirrhose gezeigt wurde. Zusätzlich zeigen sich die CD4+- und CD8+-positiven TZellpopulationen refraktär bei wiederholter Stimulation mit IL-6. Eine Präakivierung des Stat3-Signalweges wurde deutlich in Monozyten aber auch in T-Zellen von Patienten gezeigt werden.
Die Ergebnisse zeigen synergistische und antagonistische Wechselwirkungen zwischen Zytokinen, die im Kontext einer Leberzirrhose und eines ACLV als hochreguliert beschrieben wurden. Bei dauerhafter Stimulierung wurde eine ineffektive Aktivierung der IL-6/IL-22-Stat3-Signalachse in Hepatozyten und T-Zellen von Patienten in verschiedenen Stadien der Leberzirrhose gezeigt. Dies kann zur verschlechterten Leberregenerationsfähigkeit und dem gesteigerten Infektionsrisiko der Patienten beitragen.
Zukünftige experimentelle Ansätze sollten berücksichtigen, dass die Reihenfolge der Zytokingabe Einfluss auf die Wirkungsweise haben kann. Die Etablierung eines Mausmodells, welches die Leberzirrhose und ACLV darstellen kann bietet eine gute Möglichkeit, die Ergebnisse dieser Arbeit in vivo zu bestätigen und weiter zu untersuchen. Da beschrieben ist, dass IL-22 die gastrointestinale Barrierefunktion bewahrt und beeinflusst ist es außerdem von Interesse, in welchem Umfang andere Zelltypen und Gewebe von den hohen Zytokinleveln der Patienten beeinflusst werden.