Fatty acid metabolism in Sulfolobus acidocaldarius and its potential as platform organism in biotechnology
Archaea were previously classified as the third domain of life and compared to Bacteria and Eukarya, Archaea are characterized by their unique membrane lipid composition which is comprised of isoprenoid side chains ether-linked to a glycerol-1-phosphate moiety and substitutes the fatty acid based membrane structures that are ester connected to a glycerol-3-phosphate backbone in Bacteria and Eukaryotes. However, the recently proposed two domain tree of life indicated that Eukarya might have evolved from the archaeal Asgard superphylum and thus membrane lipids must have fundamentally changed from the archaeal type into the bacterial/eukaryotic one. This evolutionary differentiation of membrane structures between Archaea and Bacteria is regarded as the “lipid divide“ and raised up questions regarding the existence and the function of fatty acids in Archaea. Therefore, in course of this work the fatty acid metabolism in crenarchaeal thermoacidophilic model organism Sulfolobus acidocaldarius was analysed.
In chapter 3.1, a TetR family transcription repressor (encoded by saci_1107) was characterized and found to regulate its own expression as well as the expression of the gene cluster saci_1103-saci_1126 in S. acidocaldarius. Derepression occurred due to the binding of acyl-CoAs to the protein, upon which expression of saci_1103-saci_1126 was increased. To further confirm the repression function in fatty acid degradation, the parental strain MW001 as well as the regulator knockout strain were shown to uptake short/medium chain fatty acids such as butyrate or hexanoate, as sole carbon and energy sources. Here, the regulator mutant displayed a shorter doubling time than MW001 when growing on hexanoate. The crystal structure of this regulator was determined and displayed a similar “omega“-shaped dimeric structure in comparison to its bacterial homologue. However, the S. acidocaldarius TetR possessed a different ligand binding specificity to acyl-CoAs. Furthermore, four DNA-binding sites of the regulator were found in the fatty acid related gene cluster saci_1103-saci_1126. Thus, the data illustrated the existence and function of a distinct archaeal type TetR transcription factor.
In chapter 3.2., the FA metabolism in S. acidocaldarius was studied by analysing β oxidation homologues encoded in the gene cluster (saci_1103-1126) identified in chapter 3.1. An AMP-forming acyl-CoA synthetase for fatty acid activation and a full set of β oxidation enzymes including a FAD dependent acyl-CoA dehydrogenase, a bifunctional 3(S)-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase/enoyl-CoA hydratase (with an inverted domain structure/organization compared to well characterized bacterial homologues, e.g. from E. coli,) as well as an archaeal β-ketothiolase were characterized in detail. From the characterized single enzymes a fully functional β oxidation spiral was reconstituted in vitro and the complete oxidation of FAs to acetyl-CoA up to a chain length of C8 was demonstrated. The data further indicated that the β oxidation is not fully reversible and does thus very likely not account for FA synthesis in Archaea. Instead, the potential of S. acidocaldarius to synthesize FAs via a novel CoA dependent pathway acting independently from β oxidation enzymes is shown. The pathway comprises a bacterial like SDR superfamily R-specific fabG homolog, an MDR superfamily enoyl-CoA reductase like in some Eukaryotes, both with a clear preference for NADPH as electron donor. Furthermore, an R-specific MaoC like dehydratase was identified. The enzymes were biochemically characterized and catalysed the synthesis of medium chain FA-CoA esters up to chain lengths of C8. These results provide a basic understanding of the FA metabolism in Archaea and thus pave the way for the further understanding of the presence and significance of FA in Archaea and its evolutionary implications.
S. acidocaldarius is not only one of the important model organisms to study archaeal biology. With the combination of its broad substrate specificity, missing catabolite repression, polymer degrading capabilities and metabolic versatility, S. acidocaldarius is a promising candidate for biotechnological applications like e.g. the production of value-added products from waste materials including biofuels and base chemicals. To further elucidate this biotechnological potential, in chapter 3.3, the response of S. acidocaldarius to the widely used organic solvent 1-butanol was analyzed. Confocal laser scanning microscopy revealed the formation of a denser and higher biofilm with increased amounts of extracellular carbohydrates when exposed to 1% (v/v) 1-butanol.The transcriptomic and proteomic studies revealed that distinct regulations occurred in motility, cell envelope and membrane composition, cell division, vesicle formation, immune and defense systems as well as metabolism and general stress response. As a result, the extremophilic S. acidocaldarius displayed a high tolerance to solvent stress, exemplified by butanol exposure suggesting a great potential for industrial application.Archaeen wurden zusätzlich zu den Bakterien und Eukaryoten als dritte Domäne des Lebens identifiziert und klassifiziert. Neben anderen Unterschieden ist ein Hauptdifferenzierungsmerkmal der Archaea, dass sie im Vergleich zu Bakterien und Eukaryoten einzigartige Membranlipide besitzen. Diese sind bei Archaea aus einer Glycerin-1-phosphat-Einheiten mit ether-gebundenen Isoprenoid-Seitenketten aufgebaut, wohingegen die in Bakterien und Eukaryoten vorhandenen Membranlipideaus Glycerin-3-phosphat und ester-gebundenen Fettsäuren bestehen. Neuere phylogenetische Studien haben nun zu einem revidierten Zwei-Domänen Modell des universellen phylogenetischen Stammbaumes der Organismen geführt. Danach stellen Bacteria und Archaea die beiden ursprünglichen evolutiven Hauptlinien dar, wohingegen die Eukaryoten später aus dem archaealen Asgard Superphylum hervorgegangen sind. Dieses Modell setzt jedoch einen fundamentalen Wechsel in der Membranbeschaffenheit während der Eukaryoten-Evolution vom archaealen zum bakteriellen/eukaryotischen Typus voraus. Diese evolutive Differenzierung der Membranen von Archaeen und Bakterien wurde als „Lipid Divide“ bezeichnet und wirft die Frage nach der Existenz und der Funktion von Fettsäuren in Archaeen auf. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit der Fettsäuremetabolismus im crenarchaealen thermoacidophilen Modellorganismus Sulfolobus acidocaldarius untersucht.
In Kapitel 3.1 wurde ein Transkriptionsrepressor der TetR-Familie (kodiert durch saci_1107) charakterisiert, der neben seiner eigenen Expression auch die Expression des Genclusters saci_1103-saci_1126 in S. acidocaldarius reprimiert. Eine Aufhebung der Reprimierung und damit eine Induktion der Genexpression trat durch die Bindung von Acyl-CoAs auf. Um diese Repressor-Funktion des TetR Regulators im Fettsäureabbau weiter zu bestätigen, wurde der S. acidocaldarius MW001 Wildtyp-Stamm und der Regulator-Knockout-Stamm mit den Fettsäuren Butyrat und Hexanoat als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle kultiviert. Dabei zeigte die TetR-Mutante eine kürzere Verdopplungszeit im Vergleich zum MW001 Wildtyp. Die Kristallstruktur des Regulators wurde aufgeklärt und zeigte eine "Omega"-förmige Dimerstruktur, die der Struktur des bakteriellen Homologs ähnelt. Das S. acidocaldarius Homolog besaß jedoch Bindungsspezifität zu verschiedenen Acyl-CoAs. Weiterhin wurden vier DNA-Bindestellen des Regulators in dem o.e. Cluster von Genen (saci_1103-saci_1126) identifiziert, die vermutlich Fettsäuremetabolismus-assoziierte Proteine kodieren. Insgesamt klärt diese Studie die Funktion eines bisher unbekannten besonderen archaealen TetR-Transkriptionsfaktors auf.
In Kapitel 3.2 wurde der Fettsäuremetabolismus in S. acidocaldarius weiter untersucht, indem die Funktion von Homologen der β-Oxidation analysiert wurde, die in dem in Kaptiel 3.1. identifizierten Gencluster kodiert sind. Die Proteine wurden rekombinant hergestellt und gereinigt. Eine AMP-bildende Acyl-CoA-Synthetase zur Fettsäureaktivierung sowie ein vollständiger Satz der an der β-Oxidation beteiligten Enzyme zum Fettsäureabbau wurde im Detail charakterisiert, einschließlich einer FAD-abhängigen Acyl-CoA-Dehydrogenase, einer bifunktionellen 3(S)-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase/Enoyl-CoA-Hydratase mit einer im Vergleich zu gut charakterisierten bakteriellen Homologen entgegengesetzten Domänenstruktur, und einer archaealen β-Ketothiolase. Aus den einzelnen Enzymen wurde dann eine vollständige in-vitro Enzymkaskade zur Oxidation kurz-/mittelkettiger Acyl-CoAs einschließlich Butyryl-CoA, Hexanoyl-CoA oder Octanoyl-CoA rekonstituiert und deren Funktionalität mittels HPLC nachgewiesen. Die Ergebnisse sprechen zudem dafür, dass die β-Oxidation als Ganzes nicht reversibel arbeiten kann und deswegen sehr wahrscheinlich nicht eine eventuelle Fettsäuresynthese in Archaea katalysiert. Stattdessen indizieren im Rahmen dieser Arbeit erzielte Ergebnisse, dass S. acidocaldarius das Potential hat, Fettsäuren über einen neuartigen CoA-abhängigen Stoffwechselweg zu synthetisieren, der komplett unabhängig von der β-Oxidation arbeiten kann und sich wesentlich von den bakteriellen und eukaryontischen Homologen unterscheidet. Bei den beteiligten Enzymen handelt es sich zum Einen um eine Acetoacyl (ketoacyl)-CoA-Reduktase der SDR-Familie, einem Homolog des bakteriellen fabG, und zum Anderen um eine Enoyl-CoA-Reduktase der MDR-Familie, die den eukaryotischen Kandidaten ähnlicher ist. Beide Enzyme wurden als NADPH- und CoA-Ester-abhängig charakterisiert. Weiterhin wurde eine MaoC-ähnliche 3(R)-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratase identifiziert. Mit diesen Enzymen wurde in vitro eine Enzymkaskade rekonstituiert, die die Synthese von gesättigten Fettsäure-CoA Estern bis zu Kettenlängen von C8 katalysieren kann. Insgesamt tragen die hier erzielten Ergebnisse zum grundsätzlichen Verständnis des Fettsäuremetabolismus in Archaea bei und werden es weiter ermöglichen, das Vorhandensein und die Funktion von Fettsäuren in Archaea und deren Bedeutung für die zelluläre Evolution zu verstehen.
S. acidocaldarius ist aber nicht nur ein wichtiger Modellorganismus, um die Biologie der Archaea im Allgemeinen zu verstehen. Der Organismus ist mit seiner breiten Substratspezifität, fehlender Katabolitrepression, seiner polymer-abbauenden Eigenschaften und der metabolen Vielseitigkeit zunehmend auch ein Kandidat für biotechnologische Anwendungen wie beispielsweise für die Produktion von Biotreibstoffen oder Basischemikalien. Um dieses bíotechnologische Potential von S. acidocaldarius weiter zu untersuchen, wurde Kapitel 3.3 die Stressantwort von S. acidocaldarius auf das vielseitig und vielfach eingesetzte organische Lösemittel 1-Butanol analysiert. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie offenbarte die Bildung eines dichteren und höheren Biofilms mit einer erhöhten Menge an extrazellulären Kohlenhydraten bei einer Exposition in 1% (v/v) 1-Butanol. Transkriptom- und Proteom-Studien deckten veränderte Genexpressionen zur Regulation der Motilität, Zellhülle- und Membranzusammensetzung, Zellteilung, Vesikelbildung, Immun- und Abwehrsysteme sowie Metabolismus und allgemeiner Stressreaktionen auf. Insgesamt wies der extremophile Organismus S. acidocaldarius eine höhe Toleranz gegenüber Lösemittel (Butanol), somit ergibt sich ein großes Potenzial für zukünftige industrielle Anwendungen.