Characterization of HLA class II negative and HLA class II positive subpopulations from melanoma metastases
Melanoma remains the most common cause of death among patients with skin cancer. The most common oncogenic BRAFV600E mutation induces a constitutive activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway. Likewise mutations affecting the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) / Protein kinase B (AKT) pathway have been found in more advanced melanoma. Therapy resistance to pathway inhibitors and immunotherapy remains a major challenge in the treatment of metastatic patients. Improvement of therapy outcome depends on studies linking melanoma cell biology and immunology. Interestingly, a subset of melanoma cells constitutively expresses Human Leukocyte Antigen class II (HLAII) surface molecules presenting antigens to CD4+ T-cells. Physiologically, HLA-II expression is restricted to professional antigen presenting cells and so far the regulation of constitutive HLA-II expression in melanoma is poorly defined. This project studied MAPK and PI3K/AKT signaling in the regulation of HLA-II expression, linking HLA-II positivity to tumor cell differentiation. HLA-II expressing melanoma subpopulations were separated from three bulk cell lines (Malignant-Melanoma (Ma-Mel) -61a, -86b, -86c). Western blot analyses revealed lower expression of differentiation proteins in two HLA-II positive (pos.) melanoma populations and all three HLA-II pos. cell subsets showed higher levels of pERK, suggesting HLA-II expression could be linked to the MAPK pathway. 72 hour treatment of these cells with a specific BRAFV600E inhibitor however did not affect HLA-II surface expression. Similar results were obtained when treating with combined inhibitors targeting the PI3K/AKT and MAPK pathways. Protein analyses showed a slight increase in total HLA-II expression, as well as differentiation proteins (Melan-A) after combined inhibitor treatment in two cell lines. According to the more de-differentiated cell state, HLA-II pos. melanoma cells showed higher invasiveness (Ma-Mel-61a). In summary, this study demonstrated elevated activation of the MAPK pathway in HLA-II pos. melanoma cells but blocking the pathway did not affect HLA-DR surface expression. These findings suggest that under the experimental conditions tested, MAPK signalling is not driving constitutive HLA class II expression indicating involvement of other mechanisms.
Hautkrebs. Die häufigste onkogene BRAFV600E-Mutation induziert eine konstitutive Aktivierung des mitogen-activated protein kinase (MAPK)-Signalweges. Mutationen, die den Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) / Proteinkinase B (AKT)-Signalweg betreffen, wurden bei fortgeschrittenen Melanomen gefunden. Die Therapieresistenz stellt nach wie vor die größte Herausforderung bei der Behandlung des metastasierten Melanoms dar. Die Verbesserung der Therapieergebnisse hängt von Studien ab, die die Biologie der Melanomzellen und die Immunologie miteinander verbinden. Interessanterweise exprimieren eine Untergruppe von Melanomzellen konstitutiv Humanes Leukozyten-Antigen Klasse II (HLA-II) auf ihrer Oberfläche, worüber sie CD4+ T-Zellen Antigene präsentieren. Physiologisch ist die HLA-II Expression auf professionelle Antigen-präsentierende Zellen beschränkt, und die Regulierung der konstitutiven HLA-II-Expression im
Melanom bisher nur unzureichend untersucht. Dieses Projekt untersuchte die
MAPK- und PI3K/AKT-Signalübertragung bei der Regulierung der HLA-IIExpression und stellte eine Verbindung zwischen der HLA-II-Positivität und der Tumorzelldifferenzierung her. Western-Blot-Analysen ergaben eine geringere Expression von Differenzierungsproteinen in zwei HLA-II-positiven (pos.) Melanompopulationen, und drei HLA-II pos. Zellsubpopulationen wiesen höhere pERK-Werte auf, was darauf hindeutet, dass die HLA-II-Expression mit dem MAPKSignalweg verbunden sein könnte. Eine 72-stündige Behandlung dieser Zellen mit einem spezifischen BRAFV600E-Inhibitor hatte jedoch keinen Einfluss auf die HLAII-Oberflächenexpression. Ähnliche Ergebnisse wurden bei einer kombinierten Behandlung mit PI3K/AKT- und MAPK-Signalweg Inhibitoren erreicht. Proteinanalysen zeigten einen leichten Anstieg der gesamten HLA-II-Expression sowie des Differenzierungsproteins Melan-A nach der Behandlung mit kombinierten Inhibitoren in zwei Zelllinien. Dem stärker entdifferenzierten Zellzustand
entsprechend zeigten HLA-II-pos. Melanomzellen eine höhere Invasivität.
Zusammenfassend zeigte die Blockierung des MAPK-Signalwegs keinen Einfluss auf die HLA-II-Oberflächenexpression. Dies deutet auf die Beteiligung anderer Mechanismen für die konstitutive HLA-Klasse-II-Expression hin.