Charakterisierung und ex vivo Untersuchung eines künstlichen Sauerstoffträgers für den Einsatz zur Konservierung von Nieren

Diese Arbeit erzählt von der Entwicklung einer zellfreien Perfusionslösung für den klinischen Einsatz bei der normothermen ex vivo Perfusion von Nieren. Hauptaugenmerk lag dabei auf der Entwicklung eines albuminummantelten künstlichen Sauerstoffträgers, der auf Perfluordecalin basiert. Seine Aufgabe ist es, das perfundierte Organ mit angemessenen Mengen an Sauerstoff zu versorgen. Als Modell für die spätere Anwendung diente die isoliert perfundierte Rattenniere.

Für die Herstellung des Sauerstoffträgers wurde die Hochdruck-Homogenisierung verwendet, ein in der Anwendung sehr einfacher, in den ablaufenden physikalischen Reaktionen aber hochkomplexer Prozess, bei dem viele Faktoren auf die entstehenden Sauerstoffträger Einfluss nehmen. Es wurden die Einflüsse von Albuminkonzentration, Druck und wiederholtem Passagieren auf die Formierung des Sauerstoffträgers während der Homogenisierung und der Lagerung beschrieben und interpretiert. Die Charakterisierung dieser Sauerstoffträger erfolgte mit dynamischer Lichtstreuung, statischer Lichtstreuung, Transmissionselektronenmikroskopie, Raster-Elektronenmikroskopie, Kernspinresonanz, Lichtmikroskopie und nasschemischen Methoden. Erst die Nutzung dieses breit gefächerten Methodenspektrums ergab ein umfassendes Bild dieser polydispersen Suspension der Sauerstoffträger. Eine leicht durchzuführende und zu standardisierende Herstellungsprozedur ergab eine Suspension, die stabil genug war, um im Modell der normothermen ex vivo Nierenperfusion getestet zu werden. Eine Optimierung der Lagerstabilität der Sauerstoffträger konnte mittels eines Temperatur- und Druckgradienten bewerkstelligt werden. Die Veränderung des Herstellungsprozesses änderte die physikalischen Eigenschaften der Sauerstoffträger teilweise drastisch, ohne deren Sauerstoffkapazität zu beeinflussen. Bei einer Lagerung über 5 Monate kam es nur zu minimalem Partikelwachstum. Allerdings wurden diese Partikel von Immun- und Tubuluszellen in Zellkultur aufgenommen.

Die Oxygenierung von Nieren die mit unterschiedlichen Volumenfraktionen der Sauerstoffträger perfundiert wurden wurde durch die Quantifizierung von Hypoxie-induzierbaren Faktoren im Gewebe überprüft. Messungen der glomerulären Filtrationsrate, der biochemischen Zellschädigungsparameter in Perfusionslösung und Urin, die histochemische Untersuchung des Organs und die Quantifizierung von Malondialdehyd im Urin identifizierten eine Volumenfraktion von 4 % als die optimale Konzentration von Sauerstoffträgern für diesen Einsatz. Bei dieser Volumenfraktion wurde sowohl eine Hypoxie als auch eine Hyperoxie verhindert. Verglichen mit Erythrozyten als physiologischem Sauerstoffträger zeigten Nieren, die mit dem aus Perfluordecalin hergestellten Sauerstoffträger sechs Stunden perfundiert worden waren, mäßige Schädigungsparameter. So zeigten diese Nieren einen vermehrten Abbau von Glykogen und tendenziell weniger Nekrosen im inneren Nierenmark. Während der Perfusion mit Erythrozyten trat Hämolyse auf, die zwei Effekte hervorrief. Zum einen konnte das Abfangen von Stickoxiden durch freies Hämoglobin und ein resultierender Muskeltonus die Glomeruli schützen. Zum anderen konnte ein gesteigerter Hämoglobin-induzierter Zelltod in den Zellen des äußeren Nierenmarks beobachtet werden.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Ergebnisse der hier verwendeten Sauerstoffträger trotz einiger Probleme einen Einsatz in der klinischen normothermen ex vivo Perfusion nicht ausschließen. Die Sauerstoffversorgung des Organs wird über viele Stunden hinweg gewährleistet. Die Veränderung des Herstellungsprozesses führt zu einer ausreichenden Lagerstabilität, die den Einsatz im klinischen Alltag ermöglicht.

This work displays the development of a cell-free perfusion solution for clinical use in the normothermic ex vivo perfusion of kidneys. The specific ability of the solution was to supply an isolated perfused rat kidney with adequate amounts of oxygen. Therefore, the focus of this work was on the development and characterization of an albumin-coated artificial oxygen carrier based on perfluorodecalin.

The oxygen carriers were produced via high-pressure homogenization, a process that is very simple to use, but highly complex in the physical reactions that take place, with many factors influencing the oxygen carriers during formation. This work describes and interprets the impact of albumin concentration, pressure and repeated passages on the formation during homogenization and its influence in storage stability. The characterization of these oxygen carriers comprised dynamic light scattering, static light scattering, and transmission electron microscopy, scanning electron microscopy, nuclear magnetic resonance, light microscopy and wet-chemical methods. Only the use of this wide range of methods provided a comprehensive picture of this polydisperse suspension of oxygen carriers. Optimization of oxygen carriers synthesis  resulted in a suspension, which was stable enough for tests in the ex vivo normothermic kidney perfusion. The storage stability of the oxygen carriers could be optimized by means of a temperature and pressure gradient. Adaptations in the manufacturing process changed the physical properties of the oxygen carriers, sometimes drastically, but without affecting their oxygen capacity. When stored for 5 months, there was minimal particle growth. Immune cells and tubular cells tended to take up these particles in cell culture.
The perfusion was conducted with different volume fractions of oxygen carriers. The oxygenation of the organ was checked by quantifying hypoxia-inducible factors in the tissue. Measurements of the glomerular filtration rate, of biochemical cellular injury and oxidative stress parameters in the perfusion solution and the urine, and the histochemical examination of the organ identified a volume fraction of 4% as the optimal concentration. This volume fraction prevented both hypoxia as well as hyperoxia.
 
In comparison with red blood cells, kidneys perfused with the oxygen carrier made from perfluorodecalin for six hours showed moderate damage e.g. an increased breakdown of glycogen. They tended to cause less necrosis in the inner renal medulla. Hemolysis occurred during red blood cell perfusion revealing two effects. On the one hand, the trapping of nitrogen oxides by free hemoglobin  that might have resulted in a muscle tone protecting the glomeruli. On the other hand, increased hemoglobin-induced cell death appeared in the outer renal medulla. 
Summarized, this work developed and characterized a promising artificial oxygen carrier, which supplied the kidney with sufficient amounts of oxygen for many hours. Adaptations in the manufacturing process led to appropriate storage stability, which enables use in everyday clinical practice.

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