Neutrophile extrazelluläre Netze und die Aktivität der Serumnukleasen bei Patienten mit Sepsis

Wir stellten die Hypothesen auf, dass

  1. die Bildung von neutrophil extracellular traps (NETs) bei septischen Patienten in vitro im Vergleich zu gesunden Probanden erhöht ist,
  2. chirurgische Eingriffe ebenfalls eine NETs-Bildung induzieren,
  3. neutrophile Granulozyten septischer Patienten durch Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) in vitro stimuliert werden,
  4. hitzeinaktivierte Staphylokokkus aureus (S. aureus) die NETs-Bildung induzieren,
  5. Cytosine-Guanosin-Dinukleotidmotive (CpG) und mitochondriale DNA (mtDNA) die Bildung von NETs in vitro beeinflussen und
  6. die Aktivität der Serumnukleasen bei septischen und postoperativen Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden erhöht ist.

Die erste und zweite Hypothese wurden widerlegt, es zeigte sich eine reduzierte NETs-Bildung bei Patienten mit Sepsis unter basalen Bedingungen in vitro. Nach chirurgischem Eingriff unterschied sich die NETs-Bildung nicht von der gesunder Probanden. Die reduzierte NETs-Bildung bei septischen Patienten könnte ein Schutzmechanismus vor extrem hoher NETs-Konzentration bei einer meist starken Vermehrung der neutrophilen Granulozyten sein. Nach Stimulation mit PMA zeigte sich eine starke NETs-Freisetzung sowohl bei Patienten mit Sepsis als auch bei gesunden Probanden. Unabhängig von der unterschiedlichen NETs-Freisetzung unter basalen Bedingungen waren die neutrophilen Granulozyten also gleich stark zur NETs-Bildung aktivierbar. Nach Normierung auf die NETs-Bildung unter basalen Bedingungen stellte sich sogar eine stärkere Induktion bei Patienten mit Sepsis dar.

Weder hitzeinaktivierte S. aureus noch CpG oder mtDNA hatten einen signifikanten Einfluss auf die NETs-Bildung, was dafür spricht, dass nicht Oberflächenmoleküle alleine die Ausschleusung von NETs auslösen können.  Die Aktivität der Serumnukleasen war im Gegensatz zu unserer Hypothese bei septischen und postoperativen Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden erniedrigt. Dies könnte eine vermehrte Bildung von NETs in vivo ermöglichen. Ebenso stellt sich hier ein möglicher therapeutischer Ansatz dar, um den Organismus vor den negativen Effekten der NETs, wie einem Multiorganversagen, zu schützen, indem man eine Behandlung mit exogenen Nukleasen durchführen könnte.

Background: There is little knowledge, whether in patients with sepsis neutrophil extracellular trap (NET) formation and NET degrading nuclease activity are altered. Thus, we tested the hypotheses that 1) NET formation from neutrophils of septic patients is increased compared to healthy volunteers, both without stimulation and following incubation with mitochondrial DNA (mtDNA), a damage-associated molecular pattern, or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; positive control) and 2) that serum nuclease activities are increased as well.

Methods: Following ethic committee approval, we included 18 septic patients and 27 volunteers in this prospective observational trial. Blood was withdrawn and NET formation from neutrophils was analyzed in vitro without stimulation and following incubation with mtDNA (10µg/well) or PMA (25nmol). Furthermore, serum nuclease activity was assessed using gel electrophoresis.

Results: In contrast to our hypothesis, in septic patients, unstimulated NET release from neutrophils was decreased by 46.3% (4.3%±1.8 SD vs. 8.2%±2.9, p≤0.0001) and 48.1% (4.9%±2.5 vs. 9.4%±5.2, p=0.002) after 2 and 4 hours compared to volunteers. mtDNA further decreased NET formation in neutrophils from septic patients (4.7%±1.2 to 2.8%±0,8; p=0.03), but did not alter NET formation in neutrophils from volunteers. Of note, using PMA, as positive control, we ensured that neutrophils were still able to form NETs, with NET formation increasing to 73.2% (±29.6) in septic patients and 91.7% (±7.1) in volunteers (p=0.22). Additionally, we show that serum nuclease activity (range: 0-6) was decreased in septic patients by 39.6% (3±2 vs 5±0; median and ICR, p=0.0001) compared to volunteers.

Conclusions: Unstimulated NET formation and nuclease activity are decreased in septic patients. mtDNA can further reduce NET formation in sepsis. Thus, neutrophils from septic patients show decreased NET formation in vitro despite diminished nuclease activity in vivo.

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