UL145: Identifikation und Charakterisierung eines ULb’-Region kodierten Interferon-Antagonisten des humanen Cytomegalovirus
Das humane Cytomegalovirus (HCMV) kann schwerwiegende Krankheitsverläufe in immunnaiven und immunkomprimierten Patienten verursachen. Auch in Immungesunden entgeht HCMV der Eliminierung durch das Immunsystem durch eine Vielzahl von Immunevasionsmechanismen, die eine Virusreplikation und eine lebenslange Latenz ermöglichen. Als Teil der angeborenen Immunität sind Interferone (IFN) und die IFN-induzierte Signaltransduktion über sog. Januskinasen (Jak) und signal transducer and activator of transcription (STAT)-Proteine wichtige Ziele des viralen Immunantagonismus. Das Ziel dieser Arbeit war es, den HCMV-kodierten STAT2-Antagonisten zu identifizieren und zu charakterisieren. Durch loss-of-function und gain-of-function Strategien wurde das ULb‘-Produkt pUL145 identifiziert: Die Deletion von UL145 führte zum Verlust der STAT2-Degradation, während die (Re-)Insertion einen Funktions(rück)gewinn induzierte. Transfektionsexperimente zeigten, dass pUL145 ausreicht, um einen Dosis-abhängigen STAT2-Abbau zu vermitteln. Dadurch inhibiert pUL145 die IFNα- und IFNλ-induzierte Jak-STAT-Signalweiterleitung, die andernfalls zu einem antiviralen Genexpressionsprofil führen würde.
pUL145 bindet STAT2 und rekrutiert den Cul4-RocA-Ubiquitinligasekomplex über eine Interaktion mit DNA damage binding protein 1 (DDB1), sodass STAT2 ubiquitiniert und proteasomal abgebaut wird. Sequenzanalysen und die Mutagenese stark konservierter Aminosäuren in pUL145 demaskierten ein pUL145:DDB1-Interaktionsmotiv. Dieses Motiv ermöglichte die Identifizierung eines weiteren HCMV-kodierten DDB1-Interaktionspartners: pRL1. Die vorhergesagte pRL1:DDB1-Interaktion wurde mit einer epitopmarkierten Virusmutante in Koimmunopräzipitationen experimentell gezeigt. Ribosome profiling-Analysen wiesen auf zwei open reading frames im UL145-Locus hin. Erstmals wurde die Expression von zwei stabilen pUL145-Proteinisoformen durch die Epitopmarkierung von UL145 und Startcodonmutationen im viralen Genom gezeigt. Während beide Isoformen sich in den oben beschriebenen Funktionen glichen, wurden unterschiedliche Expressionskinetiken festgestellt. Diese legen nahe, dass die kürzere, nicht-kanonische Proteinisoform die abundantere und frühere Isoform von pUL145 ist.
Ein molekulares Verständnis von viralen Immunevasinen wie pUL145 könnte langfristig zur Entwicklung attenuierter Impfviren oder pharmakologischer Wirkstoffe beitragen, da ihre Inhibierung zur Wiederherstellung des Immunsystems und zur Eingrenzung der viralen Replikation führen kann.The human cytomegalovirus (HCMV) can cause morbidity and mortality in individuals with immature or compromised immunity. In immune competent individuals, HCMV avoids elimination by the immune system by encoding numerous immune evasion strategies to replicate and to establish a lifelong latency. Interferons (IFN) and the IFN-induced signaling via janus kinases (Jak) and signal transducer and activator of transcription (STAT) proteins are part of the innate immunity and important targets of viral immune antagonism. The aim of this thesis was the identification and characterization of the HCMV-encoded STAT2 antagonist. By loss-of-function as well as gain-of-function approaches, the ULb’ gene product pUL145 was identified: A deletion of UL145 resulted in the loss of the STAT2 degradation capacity while a (re)introduction of the gene led to a recovery of the phenotype. In transfection experiments, pUL145 was sufficient to downregulate STAT2 in a dose-dependent manner. Thus, pUL145 inhibited the IFNα- and IFNλ-induced Jak-STAT-signaling which would otherwise lead to an antiviral gene profile.
pUL145 binds STAT2 and recruits the Cul4-RocA-ubiquitin ligase complex by interacting with the DNA damage binding protein 1 (DDB1). Subsequently, STAT2 is ubiquitinated and degraded. Sequence analyses and mutation of highly conserved amino acids in pUL145 uncovered the pUL145:DDB1 interaction motif. Remarkably, this motif enabled the identification of an additional HCMV-encoded DDB1-interacting protein: pRL1. Our prediction of the pRL1:DDB1 interaction was experimentally validated by a virus mutant with epitope-tagged pRL1 and co-immunoprecipitation.
Ribosome profiling analysis had shown two open reading frames in the UL145 locus. For the first time, the expression of two stable pUL145 protein isoforms were shown by introduction of an epitope tag and start codon mutations in UL145 in the viral genome. While both isoforms downregulated STAT2 and co-precipitated STAT2 and DDB1, they were expressed with different kinetics. Interestingly, the non-canonical short isoform was expressed earlier and more abundantly, indicating this so far neglected isoform as the predominant isoform during HCMV infection of fibroblasts.
Molecular understanding of viral immune evasins like pUL145 might provide a basis for the future development of attenuated vaccine viruses or pharmacological inhibitors since their blockage could recover immune functions and restrict the viral replication.