Auswirkungen des volatilen Anästhetikums Isofluran auf die Gen-Methylierung primärer, neuronaler, hippocampaler Zellen und der HT-22 Zelllinie
Fragestellung: Methylierung oder Demethylierung von Desoxyribonucleinsäuren- (DNA)-Abschnitten, insbesondere in Promotorregionen von Cytosin-phosphatidyl-Guanin-Dinucleotide(CpG)-Inseln, sind wichtige Mechanismen der Gen Ab-, respektive Anschaltung. Isofluran ist ein häufig verwendetes volatiles Anästhetikum. Volatile Anästhetika wie Isofluran könnten mittels epigenetischer Einflüsse eine Rolle im sich entwickelnden Gehirn spielen und etwa über Neuroinflammation oder Neuroapoptose zu Langzeitwirkungen führen. In der vorliegenden Arbeit sollten erstmals Auswirkungen von Isofluran auf die Methylierungen verschiedener Genpromotoren untersucht werden.
Material und Methodik: Zur Anwendung kamen immortalisierte HT-22 Zellen sowie primäre, hippocampale Zellen der Maus als Modelle des sich entwickelnden Gehirns. 71 relevante Gene aus den Signaltransduktionsreihen der Apoptose, Inflammation und Zytokinproduktion (3 Arrays zu je 22 Genen; 5 Einzelassays) wurden auf deren Methy- lierungsgrad getestet. Eine selektive mRNA-Expressionsanalyse schloss sich an.
Ergebnisse: Wir zeigten, dass unter Kontrollbedingungen große Unterschiede in den Methylierungen der immortalisierten Zellreihen HT-22 und primären, neuronalen Zellen desselben Gewebes (Hippocampus) bestehen. Während HT-22 Zellen nahezu vollständig methyliert sind, zeigen primäre, neuronale Zellen eine nur geringe Methylierung der untersuchten Genpromotoren. Isofluranexposition (jeweils 4 Stunden, 3% Isofluran) der HT-22 Zellen führt zu keinen signifikanten Methylierungsänderungen. In primären, neurohippocampalen Zellen (Tage 5, 6, 7) zeigten hingegen sechs Gene nach Isofluranexposition signifikante Methylierungsänderungen. Eine mRNA-Expressionsanalyse konnte beim CXC-Motiv-Chemokin 12 (CXCL12) eine signifikant reduzierte Expression nach Isofluranexposition (p = 0,023) nachweisen.
Schlussfolgerungen: Immortalisierte Zellreihen eignen sich demnach nicht für eine in vitro Prüfung epigenetischer Veränderungen durch volatile Anästhetika. In primären, neurohippocampalen Zellen konnten wir zum einen große Unterschiede hinsichtlich des Methylierungsstatus im Vergleich zu HT-22 Zellen aufzeigen und zum anderen nach Iso-fluranexposition eine signifikant erhöhte Methylierung mehrerer Gene des Inflammationsignalweges feststellen, einhergehend mit einer signifikant reduzierten CXCL12 mRNA-Expression. Diese Ergebnisse sind ein wichtiger Ansatz für die zielgerichtete Erforschung epigenetischer DNA-Veränderungen durch Anästhetika.
Background: Epigenetic modulation may play a role in anesthesia related phenotypes, such as cognitive impairment or memory loss, especially with exposure to anesthetics in the vulnerable phase of brain development. While isoflurane anesthesia can evoke neuroinflammation and neuroapoptosis in young animals, we investigated in a permanent hippocampal cell line (HT22) and in primary hippocampal neurons in an a priori in vitro analysis, whether isoflurane exposure 1) evokes DNA methylation changes in genes involved in apoptosis and inflammation, and 2) results observed in a permanent hippocampal cell line are comparable to primary hippocampal neurons. In case of methylation changes in specific genes, (3) mRNA analysis was performed to assess possible effects on gene expression.
Methods: HT22 cells and primary mouse hippocampal neurons were exposed to 3% isoflurane for 4 h and DNA (each 6 single experiments) and RNA (3 single independent experiments) were extracted. Methylation analysis (EpiTect Methyl II PCR Array Systems, Qiagen) included the methylation status of 66 genes involved in apoptosis, cytokine production, inflammatory response, and autoimmunity. Quantitative Real-Time PCR was performed using the Quantitect SYBR Green Kit on a Step One Plus.
Results: Methylation status was markedly different between immortalized HT22 cells and cultured primary
hippocampal neurons without isoflurane exposure. Of 66 genes investigated, 29 were methylated to a significantly greater degree in HT22 cells compared to primary hippocampal neurons. In cultured primary hippocampal neurons, in contrast, there was a greater methylation in several genes involved in inflammation, accompanied with significant downregulation of C-X-C motif chemokine 12 with isoflurane exposure (p = 0.023).
Conclusions: We demonstrate marked differences in gene methylation between HT22 cells and cultured primary hippocampal neurons without isoflurane exposure, with a greater methylation of several genes involved in inflammation upon soflurane exposure and significant downregulation of Cxcl12 mRNA expression in primary hippocampal neurons. Accordingly, further investigations of anesthesia related DNA methylation should be performed with special consideration being given to the choice of cells targeted for such investigations.