Regulated systems of I-Scel expression for in-depth studies of the biological effects of DSBs and DSB clusters

It is well known that classical non-homologous end joining (c-NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) are the two main conserved pathways for DSB repair in higher eukaryotes. When compromised, cells employ an alternative end-joining (alt-EJ) mechanism to repair DSBs with slower kinetics. Contrary to the c-NHEJ, which is independent of cell growth state, alt-EJ shows dependence on growth state of the cells and is compromised in quiescent cells. Surprisingly, DNA-PKcs deficient cells maintained in plateau phase displayed active and functional alt-EJ. Recent studies focused on DNA-PKcs-/- cells revealed an active involvement of DNA end resection especially in quiescence stage (G0) of the cell cycle where alt-EJ is also functional. Therefore, the current study aimed at investigating the functional role of CtIP and DNA-PKcs in the regulation of alt-EJ mediated DSB repair.

The results obtained from our experiments demonstrated a significant suppression of alt-EJ upon depletion of CtIP in exponentially growing but also in serum deprived wild type cells suggesting CtIP plays a role in DNA-PKcs proficient cells. Intriguingly and contrary to DNA-PKcs proficient cells, DNA-PKcs deficient cells maintained in exponential as well as in plateaus phase showed efficient rejoining of DSBs suggesting an active involvement of alt-EJ. It is thus reasonable to deduce that DNA-PKcs proficient cells entering quiescent state of growth show marked dependence on alt-EJ while DNA-PKcs deficient cells fail. It further suggests activated DSB processing in wild type cells requires alt-EJ dependent resection and is mainly regulated by resection component like CtIP. However, DNA-PKcs deficient cells withstand alt-EJ and its requirement of limited DNA end resection in G1 cells entering plateau phase of growth, which requires further investigation.

Contrary to DNA-PKcs mutant cell lines, Ku80 mutant cells showed a marked reduction in their DSB rejoining capacity suggesting that the absence of DNA end tethering factor Ku70/80 may allow access for CtIP to resect the DNA ends thus facilitating alt-EJ mediated repair.

We also showed a marked sensitization of cells depleted in CtIP towards ionizing radiation. Furthermore, we demonstrated a moderate radio-sensitization of cells mutant in HRR suggesting that besides its involvement in HRR, CtIP can also operate in alt-EJ repair pathway in G2 phase of the cell cycle.

To investigate whether DNA end-processing is an essential requirement for alt-EJ in G1 phase cells, we investigated the requirement for CtIP in alt-EJ in G1 phase cells, which is resection dependent albeit to a limited extent. Consistent with previous observations, we also found a significant resection activity in DNA-PKcs mutant cells.

Furthermore, we investigated the dependence of chromosome break repair on CtIP mediated resection in irradiated G0 wild type (CHO10B4) and c-NHEJ mutant cell lines (IRS-20 and XRS-6) derived from Chinese hamster ovary by examining premature chromosome condensation (PCC) breaks. In wild type cells, chromosome breaks are repaired effectively suggesting majority of IR-induced chromosome breaks are repaired through c-NHEJ. In contrast, a significant reduction is noted in c-NHEJ mutant cells suggesting a functional role of alt-EJ at the chromosome level. We thus revealed a hitherto unknown role of resection in repairing chromosomal breaks in G1 phase of the cell cycle and found that CtIP is indispensable for repair of G1-PCC breaks in CHO cells.

Taken together, our work demonstrated for the first time an important functional link between CtIP-mediated DNA end-resection and its role in repair of chromosome breaks in G1 phase of the cell cycle that is mediated by alt-EJ.

Previous findings from our laboratory demonstrated an association between persistent 53BP1 signaling and clustered-DNA damage, suggesting a compromised processing by c-NHEJ and thus shunting of DSBs towards error-prone alt-EJ at the cost of elevated chromosomal translocation formation. Consistent with this we investigated via indirect immunofluorescence the correlation between 53BP1 signaling and complex forms of DSBs It is widely accepted that the recruitment of 53BP1 to the sites of DSBs is dependent on sequential activation of two primary E3 ubiquitin ligases: RNF8 and RNF168. By RNA interference (RNAi) and subsequent immunofluorescence experiments we convincingly showed that these two ring finger E3 ligases act as a molecular linker between initial mark of DNA damage, γ-H2AX, and more downstream repair pathway choice with the help of 53BP1.

In the present study, in line with previous findings, we also observed a sustained retention of 53BP1 foci in clones harboring complex-DSBs supporting again the notion that DSB-clustering is a relevant parameter of DSB complexity. Moreover, by employing cytogenetic methods, we analyzed chromosome aberration formation at metaphase in clones sustaining single DSBs or DSB clusters of increasing complexity following expression of I-SceI, with concomitant knockdown of RNF8/168. The results obtained showed that interference in ubiquitin signaling increases the degree of erroneous processing of simple DSBs that can be manifested with high yields of chromosomal translocation formation. It suggests that when c-NHEJ is compromised, simple lesions initiate DDR signaling which is in a way reminiscent of complex types of lesions.

In order to investigate the physiological relevant of ectopically expressed GFP-53BP1 foci with endogenous 53BP1 foci, we transiently expressed in cells of plasmid expressing a fusion protein containing GFP (GFP-53BP1). Transiently expressed green fluorescence protein (GFP) tagged with a truncated version of human 53BP1 protein in rodent cells (CHO), as well as in human cells (U2OS, D-U2OS, A549), showed its distribution as GFP-53BP1 foci in the DSB-flanking chromatin. As anticipated, endogenous 53BP1, as well as exogenous GFP-53BP1 overlapped with γ-H2AX decorated chromatin in both IR and I-SceI mediated DSBs.

Since our biological model system based on DSB clusters provided insights into the increased efficacy of high-LET radiation, we further studied how depletion of RNF8 and RNF168 is regulated between their exposures to high- and low-LET radiation. We observed that in the absence of RNF8/168, parental CHO cells exhibited elevated cellular sensitivity in response to IR, while the sensitivity remained almost unaffected following α-particle irradiation indicating that the ubiquitin ligase cascade responds differentially between sparsely ionizing radiation (low-LET) and densely ionizing radiation (high-LET).

Altogether, these findings suggest that the E3 ligase cascade consisting of RNF8 and RNF168 plays a critical role in DNA damage signaling.

In höheren Eukaryoten sind die klassische nicht-homologe Endverknüpfung (c-NHEJ) und die homologe Rekombinationsreparatur (HRR) die beiden wichtigsten und lang bewährten Wege für die DSB-Reparatur. Wenn sie kompromittiert werden, verwenden Zellen einen
alternativen Endverknüpfungsmechanismus (Alt-EJ), um DSBs mit langsamerer Kinetik zu reparieren. Im Gegensatz zum c-NHEJ, das unabhängig vom Zellwachstumszustand ist, zeigt alt-EJ eine Abhängigkeit von der Wachstumsphase der Zellen und ist vor allem in ruhenden Zellen stark beeinträchtigt. Überraschenderweise zeigten DNA-PKcs-defiziente
Zellen in der Plateau-Phase funktionelle und aktive Alt-EJ. Jüngste Studien zeigten im Ruhezustand (G0) des Zellzyklus, in dem auch Alt-EJ funktionsfähig ist, eine aktive Beteiligung der DNA-Endresektion. Daher zielte die vorliegende Studie darauf ab, die funktionelle Rolle von CtIP und DNA-PKcs bei der Regulation der Alt-EJ-vermittelten DSBReparatur zu untersuchen. Die aus unseren Experimenten erhaltenen Ergebnisse zeigten nach Herunterregulierung von CtIP eine signifikante Unterdrückung von Alt-EJ in exponentiell wachsenden Wildtypzellen, aber auch unter Serumentzug, was darauf hindeutet, dass CtIP eine Rolle in DNA-PKcs-profizienten Zellen spielt. Interessanterweise und im Gegensatz zu DNA-PKcs-profizienten Zellen zeigten DNA-PKcs-Wildtyp-Zellen, die sowohl in der exponentiellen als auch in der Plateau-Phase gehalten wurden, eine effiziente Wiederverknüpfung von DSBs, was auf eine aktive Beteiligung von Alt-EJ hinweist. Es ist daher vernünftig zu folgern, dass DNA-PKcs-profiziente Zellen, die in den Ruhezustand eintreten, eine deutliche Abhängigkeit von Alt-EJ zeigen, während DNA-PKcs-defiziente Zellen hier versagen. Es legt nahe, dass die aktivierte DSB-Verarbeitung in Wildtyp-Zellen eine Alt-EJ-abhängige Resektion erfordert und hauptsächlich durch Resektionskomponenten wie CtIP reguliert wird. DNA-PKcs-defiziente Zellen widerstehen jedoch Alt-EJ und dessen
Erfordernis einer begrenzten DNA-Endresektion in G1-Zellen, die in die Plateau-Wachstumsphase eintreten, was weitere Untersuchungen erfordert. Im Gegensatz dazu zeigten Ku80-Mutantenzellen eine deutliche Verringerung ihrer DSBWiederverknüpfungskapazität, was darauf hindeutet, dass das Fehlen des DNA-End-Verbindungsfaktors Ku70/80 CtIP den Zugang zur Resektion der DNA-Enden ermöglichen könnte, wodurch die Alt-EJ-vermittelte Reparatur erleichtert wird. Wir zeigten auch eine deutliche Sensibilisierung von CtIP herunterregulierten Zellen gegenüber ionisierender Strahlung. Darüber hinaus zeigten wir eine moderate Radiosensibilisierung von Zellen, die in der HRR mutiert sind, was darauf hindeutet, dass CtIP neben seiner Beteiligung an der HRR auch im Alt-EJ-Reparaturweg in der G2-Phase
des Zellzyklus arbeiten kann.
Um zu untersuchen, ob die DNA-Endverarbeitung eine wesentliche Anforderung für Alt-EJ in G1-Phase-Zellen ist, haben wir die Anforderung für CtIP in Alt-EJ in G1-Phase-Zellen untersucht, die, wenn auch in begrenztem Umfang, resektionsabhängig ist. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen fanden wir auch eine signifikante Resektionsaktivität in DNA-PKcs-Mutantenzellen. Bei der Untersuchung der Abhängigkeit
der Reparatur von Chromosomenbrüchen von der CtIP-vermittelten Resektion stellten wir außerdem fest, dass ein erheblicher Teil der Wiederverknüpfungs-Ereignisse eine Endresektion erfordert, was auf eine funktionelle Rolle von Alt-EJ auf Chromosomenebene hindeutet. Wir haben daher eine bisher unbekannte Rolle der Resektion bei der Reparatur von Chromosomenbrüchen in der G1-Phase des Zellzyklus entdeckt und festgestellt, dass CtIP für die Reparatur von G1-PCC-Brüchen in CHO-Zellen unverzichtbar ist.
Zusammengenommen zeigten unsere Arbeiten zum ersten Mal einen wichtigen funktionellen Zusammenhang zwischen der CtIP-vermittelten DNA-Endresektion und ihrer Rolle bei der Reparatur von Chromosomenbrüchen in der G1-Phase des Zellzyklus, die durch alt-EJ vermittelt wird.
Frühere Ergebnisse aus unserem Labor zeigten einen Zusammenhang zwischen anhaltender 53BP1-Signalübertragung und DNA-Cluster-Schädigung, was auf eine beeinträchtigte Verarbeitung durch c-NHEJ und damit auf die Verlagerung von DSBs in Richtung fehleranfälliger Alt-EJ auf Kosten einer erhöhten chromosomalen Translokationsbildung hindeutet. In Übereinstimmung damit untersuchten wir mittels indirekter Immunfluoreszenz die Korrelation zwischen 53BP1-Signalen und komplexen Formen von DSBs. Es ist allgemein bekannt, dass die Rekrutierung von 53BP1 an die DSBs
von der sequentiellen Aktivierung zweier primären E3-Ubiquitin-Ligasen abhängt: RNF8 und RNF168. Durch RNA-Interferenz (RNAi) und anschließende Immunfluoreszenz-Experimente konnten wir überzeugend zeigen, dass diese beiden Ringfinger-E3-Ligasen mit Hilfe von
53BP1 als molekularer Linker zwischen der anfänglichen Markierung der DNA-Schädigung (γ-H2AX) und einer nachgeschalteten Reparaturwegwahl fungieren. In der vorliegenden Studie beobachteten wir in Übereinstimmung mit früheren Befunden auch eine anhaltende Retention von 53BP1-Foki in Klonen mit komplexen DSBs, was wiederum die Annahme stützt, dass DSB-Clustering ein relevanter Parameter der DSB-Komplexität ist. Darüber
hinaus analysierten wir mithilfe zytogenetischer Methoden die Bildung von
Chromosomenaberrationen in der Metaphase in Klonen, die einzelne DSBs oder DSBCluster mit zunehmender Komplexität nach Expression von I-SceI mit gleichzeitigem Abbau von RNF8/168 erhalten. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass eine Störung der Ubiquitin-Signalübertragung den Grad der fehlerhaften Verarbeitung einfacher DSBs erhöht, der sich mit hohen Ausbeuten in chromosomaler Translokationsbildung manifestieren kann. Es deutet darauf hin, dass bei einer Beeinträchtigung von c-NHEJ einfache Läsionen eine DDRSignalübertragung auslösen, die in gewisser Weise an komplexe Arten von Läsionen erinnert.
Um die physiologische Relevanz von ektopisch exprimierten GFP-53BP1-Foki mit endogenen 53BP1-Foki zu untersuchen, exprimierten wir transient ein GFP enthaltendes Fusionsprotein (GFP-53BP1) in Zellen. Transient exprimiertes grün fluoreszierendes Protein (GFP), das mit einer verkürzten Version des menschlichen 53BP1-Proteins in Nagetierzellen (CHO) sowie in menschlichen Zellen (U2OS, D-U2OS, A549) markiert war, zeigte seine
Verteilung als GFP-53BP1-Foki in DSB-flankierendem Chromatin. Wie erwartet überlappten endogenes 53BP1 sowie exogenes GFP-53BP1 mit γ-H2AX-dekoriertem Chromatin sowohl an IR- als auch in I-SceI-vermittelten DSBs.
Da unser auf DSB-Clustern basierendes biologisches Modellsystem Einblicke in die erhöhte Wirksamkeit von Strahlung mit hohem LET lieferte, haben wir weiter untersucht, wie die Herunterregulierung von RNF8 und RNF168 zwischen der Exposition gegenüber Strahlung mit hohem und niedrigem LET reguliert wird. Wir beobachteten, dass in Abwesenheit von
RNF8/168 parentale CHO-Zellen eine erhöhte zelluläre Empfindlichkeit als Reaktion auf IR zeigten, während die Empfindlichkeit nach Bestrahlung mit α-Partikeln nahezu unbeeinflusst blieb, was darauf hinweist, dass die Ubiquitin-Ligase-Kaskade zwischen dünn ionisierender Strahlung (Niedrig-LET) und dicht ionisierende Strahlung (Hoch-LET) unterschiedlich
reagiert. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die aus RNF8 und RNF168 bestehende E3-Ligasekaskade eine entscheidende Rolle bei der Signalübertragung von DNA-Schäden spielt.


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