Characterization of tumor-infiltrating B cells in solid tumors
Current immunotherapies focus mostly on immune cells designated as CD8+ cytotoxic T cells to fight cancer. Despite growing appreciation to the role of B cells in solid tumor microenvironments, most of the immune checkpoint blockade therapy targets are developed with the purpose to act on T cells and induce their activation. Up to now, a heterogenous impact has been ascribed to B cells infiltrating solid tumors. The presence of B cells within tumors has been correlated with improved patient survival in several studies, however, there are also investigations which describe pro-tumor roles of B cells and severe disease progression. These varying observations depend on the tumor entity and B cell subset investigated, but the exact underlying mechanisms and regulations are still only poorly understood and remain to be fully elucidated.
The aim of this project is to characterize tumor infiltrating B cells phenotypically in solid tumor entities. For this purpose, the MACSima technology is used to investigate the marker expression pattern of B cells present in solid tumors in context to their spatial localization. B cells could be detected in 21% of the samples screened. Here, tertiary lymphoid structures (TLS) like structures were identified consisting of mainly B and T cells, but also CD64+ macrophages, high endothelial venules and CD21+ follicular dendritic cells. Even though no new B cell subset could be identified to this point, the interesting observation could be made that the B cells within the TLS like structure show a prevalence of a memory B cell phenotype. In line with that, similar observation were made by flow cytometry analysis of freshly dissociated solid tumor. Interestingly, additional to that, a distinctive CD138+CD38+ plasma cell population was detected in the surrounding of the TLS like structure within the tumor by MACSima which could as well be validated by flow cytometric and RNA sequencing analysis of dissociated tumor samples. Observation of many memory B cells and plasma cells strengthens the assumption that affinity maturation might be taken place within the TLS in the tumor microenvironment, and suggesting that these cells could be secreting tumor specific antibodies. Therefore, BCR single cell sequencing was used to identify tumor-specific antibodies, combined with RNA expression profiling. Strikingly, clear abundance of BCR clones were found in pre-enriched B cell fractions, and the most dominant clone was displaying a plasma cell phenotype, characterized by expression of late B cell differentiation marker patterns. The recombinant production of the selected, most abundant antibody clone did not show binding to a majority of the respective primary tumor sample, neither to human ovarian cell lines. More tumor samples and B cell clones have to be screened and tested to increase the throughput and therefore the likelihood of identifying a suitable clone which meets the requirements for a potential future therapeutic application. These are particularly: tumor specificity while exhibiting low off tumor effects and targeting an epitope that is present on a high percentage of tumor cells and in best case shared by a substantial group of patients. Furthermore, the identification of tumor specific B cell markers contains the potential to isolate or target specific B cells. Altogether, these data augment and further validate the information about B cell phenotypes in tumors, and continued effort in this direction will pave the way for novel development B cells based immunotherapies.
Aktuelle Immuntherapien konzentrieren sich hauptsächlich auf Immunzellen zur Krebsbekämpfung, die als CD8+ zytotoxische T-Zellen bezeichnet werden. Trotz wachsender Würdigung der Rolle der B-Zellen in dem Mikromilieu solider Tumore werden die meisten Immunkontrollpunkte-Blockade-Therapien mit dem Ziel entwickelt, auf T-Zellen einzuwirken und ihre Aktivierung zu induzieren. Bislang wurde den B-Zellen, die in solide Tumore eindringen, eine heterogene Wirkung zugeschrieben. Die Präsenz von B-Zellen innerhalb von Tumoren korrelierte in mehreren Studien mit einem verbesserten Überleben der Patienten. Es gibt jedoch auch Untersuchungen, die die Pro-Tumor-Rolle der B-Zellen und das Fortschreiten der Krankheit beschreiben. Diese unterschiedlichen Beobachtungen hängen von der untersuchten Tumorentität und B-Zell-Untergruppen ab, aber die genauen, dem zugrunde liegenden Mechanismen und Regulationen sind nur unzureichend verstanden und müssen noch vollständig aufgeklärt werden.
Das Ziel dieses Projekts ist es, tumorinfiltrierende B-Zellen in soliden Tumorentitäten phänotypisch zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wird die MACSima-Technologie eingesetzt, um das Marker-Expressionsmuster von B-Zellen in soliden Tumoren im Zusammenhang mit ihrer räumlichen Lokalisation zu untersuchen. B-Zellen konnten in 21% der untersuchten Proben nachgewiesen werden. Dabei wurden TLS-ähnliche Strukturen identifiziert, die hauptsächlich aus B- und T-Zellen, aber auch aus CD64+-Makrophagen, hochendothelialen Venolen und CD21+ follikulären dendritischen Zellen bestehen. Auch wenn bis zu diesem Zeitpunkt keine neue Untergruppe von B-Zellen eindeutig identifiziert werden konnte, konnte die interessante Beobachtung gemacht werden, dass die B-Zellen innerhalb der TLS-ähnlichen Struktur eine Prävalenz eines Gedächtnis-B-Zell-Phänotyps aufweisen. In Übereinstimmung damit wurden ähnliche Beobachtungen durchflusszytometrisch an frisch dissoziierten soliden Tumoren gemacht. Interessanterweise konnte zusätzlich dazu mit der MACSima-Technologie eine ausgeprägte CD138+CD38+-Plasmazellpopulation in der Umgebung der TLS-ähnlichen Struktur innerhalb des Tumors nachgewiesen werden, die darüber hinaus durch durchflusszytometrische und RNA-Sequenzierungsanalysen dissoziierter Tumorproben validiert werden konnte. Die Beobachtung vieler Gedächtnis-B-Zellen und Plasmazellen bestärkt die Vermutung, dass innerhalb der tertiären lymphatischen Strukturen im Mikromilieus des Tumors eine Affinitätsreifung stattfinden könnte, und lässt vermuten, dass diese Zellen tumorspezifische Antikörper sezernieren. Daher wurde die BCR-Einzelzell-Sequenzierung zur Identifizierung tumorspezifischer Antikörper verwendet, kombiniert mit einer RNA-Expressionsanalyse. Erwähnenswert ist, dass eine deutlich erhöhte Anzahl von BCR-Klonen in vorangereicherten B-Zellfraktionen gefunden wurde und der dominanteste Klon einen Plasmazell-Phänotyp zeigt, der durch die Expression von einem späten B-Zelldifferenzierungsmarker-Muster gekennzeichnet ist. Die rekombinante Produktion des ausgewählten, am häufigsten vorkommenden Antikörperklons zeigte keine Bindung an einen Großteil der jeweiligen Primärtumorprobe und auch nicht an humane Ovariazelllinien. Es müssen mehr Tumorproben und B-Zell-Klone gescreent und getestet werden, um den Durchsatz und damit die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, einen geeigneten Klon zu identifizieren, der die Anforderungen an ein mögliches zukünftiges Therapeutikum erfüllt. Diese sind insbesondere: hohe Tumorspezifität bei gleichzeitig geringer Spezifität für ein unter normalen Umständen im gesunden Körper vorkommendes Epitop. Außerdem sollte das Epitop auf einem hohen Prozentsatz von Tumorzellen vorhanden sein und im besten Fall von einer beträchtlichen Gruppe von Patienten geteilt wird. Darüber hinaus beinhaltet die Identifizierung tumorspezifischer B-Zell-Marker die Möglichkeit, spezifische B-Zellen zu isolieren oder gezielt anzusprechen. Insgesamt ergänzen diese Daten die Informationen über die B-Zell-Phänotypen in Tumoren und validieren sie weiter. Weiterführende Anstrengungen in diese Richtung bieten das Potenzial den Weg für neue Immuntherapien auf der Basis von B-Zellen zu entwickeln und zu ebnen.