Die Homöostase des Replikations-Origin-Firing ist notwendig für die Vollständigkeit der Genomduplikation

Damit das genetische Gleichgewicht über viele Zellteilungen erhalten bleibt, muss die gesamte genetische Information in jedem Zellzyklus komplett und exakt einmal repliziert werden. Hierbei stellt die Initiation den zentralen Regulationsschritt der Genomreplikation dar, der entscheidet zu welcher Zeit an welchem Ort im Genom die Replikation stattfindet. Überraschend ist, dass die Feinregulation des Initiationsschrittes in Metazoa-Zellen bisher nicht vollkommen aufgeklärt wurde. Die grundlegend an diesem Prozess beteiligten Proteine, die Kern-Initiationsfaktoren, konnten bereits identifiziert werden und liegen größtenteils von der Hefe bis zum Mensch konserviert vor. Für den Kern-Initiationsfaktor Sld7 konnte bisher jedoch kein Ortholog in Metazoa-Zellen nachgewiesen werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde sowohl eine Sequenz- als auch funktionelle-Homologie von MTBP und Sld7 nachgewiesen. Durch die eindeutige Identifikation von MTBP als Kern-Initiationsfaktor konnte final gezeigt werden, dass die grundlegenden molekularen Mechanismen der Hefe-Initiation in Metazoa-Zellen konserviert vorliegen.

Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass Metazoa-spezifische Domänen und Funktionen für die Etablierung eines Origin-Firing-Gleichgewichts (deutsch: Replikationsursprungs-Feuerungs-Gleichgewichts) notwendig sind und MTBP eine zentrale Regulationsplattform hierfür darstellt. Die Phosphorylierung von MTBP durch verschiedene Zellzyklus- und Checkpoint-Kinasen übernimmt eine wichtige Funktion für die Erhaltung dieses Origin-Firing-Gleichgewichts. Darauf aufbauend konnte durch die systematische Dysregulation der Origin-Firing-Frequenz mit chemischer Inhibition, RNAi und Gen-Knockouts in Zellkulturen gezeigt werden, dass die Zellen sensitiv auf ein negatives Origin-Firing-Gleichgewicht reagieren, wodurch Replikationsstress entsteht, der die Entstehung von Replikationslücken begünstigt. Dieser Replikationsstress basiert auf der niedrigen Konzentration von Origin-Firing-Faktoren- und Ereignissen und wird daher als low initiation factor activity induced replication stress (LIRS) bezeichnet. Ob der Checkpoint in einer solchen Situation aktiviert werden kann war zuvor unklar, da klassischer Replikationsstress durch Einzelstrang-DNA detektiert wird. In Situationen mit einer misregulierten Origin-Firing-Frequenz könnte jedoch nicht der Zusammenbruch von Replisomen und die dadurch entstehende Einzelstrang-DNA, sondern die limitierende Anzahl aktiver Replisomen das primäre Problem sein. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass LIRS die Checkpoint-Antwort der Zellen aktivieren kann. LIRS führt desweiteren zu unterreplizierten Genombereichen sowie Problemen in der cytokinetischen Abschnürung.

Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass eine hemizygote Mutation in einem MTBP-Allel zu einer erhöhten Mutationsrate führt und somit zur Entstehung von genetischer Instabilität beiträgt. Eine leichte Reduktion der zellulären MTBP-Protein-Konzentrationen resultiert bereits in Replikationsstress, reicht alleine jedoch nicht aus um das Replication Timing oder eine Checkpoint-Antwort auszulösen.

Anhand der durchgeführten Experimente konnte zum ersten Mal ein Zusammenhang zwischen einer limitierenden Initiationsfrequenz und der Entstehung von Replikationsstress sowie genetischer Instabilität nachgewiesen werden.

The genome needs to be duplicated exactly once per cell cycle to guarantee genetic homeostasis over consecutive rounds of cell-divisions. The initiation step of DNA-replication is the major regulation step to decide if, when and where replication is taking place. Surprisingly, the fine regulation of this step in metazoa cells is not completely known yet. The underlying processes and the main proteins involved in this step have already been described using yeast-cells. Most of these proteins exist in a conserved form from yeast to human. To date no metazoa-ortholog of the key-initiationfactor Sld7 was clearly identified. For the first time we were able to show sequence- and functional homology between MTBP and Sld7 and finaly prove that these factors are ortholog proteins. These findings now show that the set of key-initiation factors and molecular processes involved in the origin firing step of replication are conserved from yeast to human.

Additionally, metazoa-specific domains and functions of MTBP were identified that help maintain origin firing homeostasis and establish MTBP as a regulation platform for this process.Phosphorylation of MTBP by the checkpoint- and cell-cycle-kinases is important for maintaining origin firing homeostasis. By systematically modulating firing efficiency using chemical inhibitors for DDK, RNAi against MTBP and Treslin as well as genetic knock-outs it was established that origin firing homeostasis is important to avoid replication stress and the development of under-replicated gaps. So far it was not known if limiting initiation can trigger the replication-checkpoint because normaly this checkpoint is being activated by the detection of single-stranded DNA (ssDNA). Assuming that low initiation factor activity induced replication stress (LIRS) does not primarily lead to the generation of ssDNA but leaves the cell with unreplicated gaps it was not known if the checkpoint would be triggered in these situation. We were able to show that the checkpoint can be induced by LIRS and that mitotic DNA synthesis as well as delayed cytokinetic abscission are the consequences of a misregulated firing homeostasis.

Furthermore it was shown that a hemizygous mutation in one MTBP-allele leads to a reduced expression of MTBP-protein and that this reduction of MTBP alone might not be enough to trigger the replication checkpoint. Using RNAi and depleting the cells of the same amount of MTBP we were able to show that cells already do experience LIRS in these situation which was shown by an increase in delayed cytokinetic abscission events. This does not primarily change replication timing in the cells but does lead to a higher mutation rate reflecting the existence of genetic instability which might lead to cancer formation.

In conclusion we were able to show that origin firing-homeostasis is crucial to avoid the induction of replication-stress and to maintain genetic stability and therefore for the first time connect origin firing-frequency to these processes.

Cite

Citation style:
Höfer, V., 2020. Die Homöostase des Replikations-Origin-Firing ist notwendig für die Vollständigkeit der Genomduplikation. https://doi.org/10.17185/duepublico/73411
Could not load citation form.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export