Evaluierung von Tumorzellselektionsverfahren im Blut von Patientinnen mit gynäkologischen Tumoren zur Tumoreinzelzellanalyse auf RNA- und DNA-Ebene

Sowohl beim Mamma- als auch beim Ovarialkarzinom kommt es trotz guter Behandlungsmöglichkeiten häufig zum Rückfall der Erkrankung (Rezidiv) oder zur Metastasierung. Dies geschieht vermutlich durch einzelne Tumorzellen, die sich frühzeitig vom Primärtumor lösen, in die Blutzirkulation gelangen (zirkulierende Tumorzellen; ZTZ) und in sekundäre Organe einwandern, dort ruhen und zu einem späteren Zeitpunkt eine Metastasierung verursachen können. Mittlerweile gibt es viele verschiedene Methoden zur Selektion von ZTZ, wobei ihre Detektion zellulär oder molekularbiologisch erfolgt. Jedoch kann bei der Gesamtanalyse von ZTZ letztendlich nicht bestimmt werden, ob ein Marker von mehreren ZTZ in der Gesamtpopulation oder nur von einer Zelle exprimiert wird. Deshalb rückt die Einzelzellanalyse vermehrt in den Vordergrund, da sie den Vorteil bietet, die Charakteristika der Einzelzelle aufzuzeigen. In diesem Zusammenhang war es Ziel dieser Dissertation, eine in der Arbeitsgruppe etablierte, immunomagnetische Positivselektion (AdnaTest) als Basis für die Charakterisierung einzelner ZTZ mittels CellRaftSystem, einer Einzelzellisolierplattform, auf Transkriptomebene zu evaluieren. Für die Analysen der Einzelzellen auf Genomebene sollte eine Negativdepletion unerwünschter Leukozyten etabliert werden, um ZTZ im sogenannten DEPArrayTM System, basierend auf Lokalisation einzelner Zellen in einem elektrischen Feld mit kombinierter Fluoreszenzmikroskopie, zu charakterisieren. Neben „Spike in“ Experimenten von Tumorzelllinien in gesundem Probandinnenblut sollte die erfolgreichste Methodik Anwendung im Blut von metastasierten Mammakarzinom- und primären varialkarzinompatientinnen finden.
Die Kombination aus AdnaTest und CellRaftSystem, mit anschließender Transkriptomanalyse einzelner ZTZ, fand in Blutproben von metastasierten Mamma- und primären Ovarialkarzinompatientinnen sowie gesunden Probandinnen Anwendung. Die immunomagnetisch selektierten Tumorzell-Bead-Komplexe wurden mit Hilfe der Mikromanipulation aus einer Gelmatrix isoliert und die in cDNA transkribierte mRNA für die Sequenzierung auf RNA-Ebene verwendet. Trotz erheblich reduzierter Leukozytenzahl war jedoch nur ein geringer Prozentsatz der selektierten ZTZ zur Sequenzierung geeignet. Es zeigte sich eine heterogene Genüberexpression bei Tumorpatientinnen und gesunden Probandinnen, die bei beiden Tumorentitäten am Häufigsten überexprimierten Gene waren der Angiogenese und dem Zellzyklus zugeordnet. Das zur Optimierung der Sequenzierung und zum Ausschluss bzw. Minimierung falsch-positiver Ergebnisse genutzte QIAseqTM UPX3´ Transcriptome Kit, sogenannte Unique Molecular Identifiers (UMIs) beinhaltend, erlaubte die anschließende Sequenzierung von fast 90 % der von fünf selektierten Mamma-, 50 % der von 12 Ovarialkarzinompatientinnen sowie 75 % der von fünf gesunden Probandinnen selektierten Zellen. Während bei gesunden Probandinnen in erster Linie Pseudogene vorlagen, zeigten sich bei 50 % der Tumorpatientinnen Gemeinsamkeiten der am Häufigsten überexprimierten Gene, 20 % davon mit dem zellulären Transport assoziiert. Zusammenfassend war die letztere Vorgehensweise sehr erfolgreich, um für weitere klinische Fragestellungen gezielt die Gene in den jeweiligen Signalwegen zu identifizieren.
Des Weiteren wurden für eine vorangeschaltete Selektion der ZTZ und zur späteren Charakterisierung der Zellen auf Genomebene, für die DEPArray™ System Analyse, sogenannte „Spike-in“-Experimente auf Zellkulturebene getestet. Dazu zählten, die Dichtegradientenzentrifugation, das Immunodensitivitätsverfahren RosetteSepTM zur ZTZ Isolation aus Vollblut, das vergleichbare MACS®-System, sowie das ParsortixTM System, eine Mikrofluidtechnologie zur Isolierung von ZTZ aufgrund ihrer geringeren Verformbarkeit und der im Vergleich zu Blutzellen meist größeren Größe. Letzteres wies gerade bei den Ovarialkarzinomzelllinien schlechte Wiederfindungsraten auf. Trotz relativ guter Ergebnisse bei den anderen Tumorentitäten, war die Zellreduktion mit ca. 50 % durch die Isolation der Zellen aus dem Gerät zu hoch, um für weitere Untersuchungen verwendet zu werden. Die Dichtegradientenzentrifugation zeigte zwar gute Wiederfindungsraten, war jedoch durch die Kontamination mit zu vielen unerwünschten Zellen, meist Leukozyten, eher ungeeignet für das DEPArrayTM System mit limitierter Beladungskapazität. Auch das RosetteSepTM erfüllte trotz guter Anreicherungsraten nicht die hier gewünschten Kriterien. Das in dieser Arbeit modifizierte MACS®-System mit doppeltem Säulendurchlauf jedoch zeigte Wiederfindungsraten von 13-75 % bei Ovar-und Mammakarzinomzelllinien, sowie eine 96 % Leukozytendepletion. Bei 10/16 Patientinnen mit Ovarialkarzinom wurden anschließende Gesamt Genom Amplifikation (WGA) und Copy number variations (CNV)-Analysen für 76 potentielle ZTZ durchgeführt, von denen aber nur bei 2/10 Patientinnen drei Zellen einen malignen Charakter aufwiesen. Zusammenfassend konnte hier eine effektive Anreicherung der ZTZ etabliert werden, jedoch muss die Charakterisierung der ZTZ im DEPArray™ System optimiert werden, um eine Charakterisierung mittels Sequenzierung durchführen zu können.
Insgesamt ist der in dieser Arbeit gewählte Ansatz zur umfassenden Charakterisierung einzelner ZTZ vielversprechend für zukünftige klinische Fragestellungen, jedoch muss die Methodik nicht nur weiter optimiert, sondern auch Kosten günstiger werden, um sie für Patientinnen zur Anwendung zu bringen.

Despite good treatment options, breast and ovarian carcinoma patients are often experiencing relapse (recurrence) of the disease or metastasis. This might be explained by the micrometastatic spread of tumor cells that leave the tumor early, enter the circulation (circulating tumor cells; CTC), migrate into secondary organs and rest there, to finally form metastasis in the follow-up of the disease. There are many different CTC selection methods available followed by their detection on the cellular and/or molecular level. However, analyzing the whole bulk of CTCs does not give information whether a co-expression of more than one CTC-marker is derived from one CTC actually co-expressing these markers or from separate CTCs. Therefore, the single cell analysis is getting more attention as it offers the advantage of revealing the characteristics of the single cell. In this context, it was the aim of this dissertation to evaluate an immunomagnetic positive selection (AdnaTest) already established in the working group, combined with the CellRaftSystem, a single cell isolation platform for the characterization of single CTC on the transcriptome level. For the analysis of single cells on the genome level, it was the aim to establish a method for negative selection. Thus, depletion of unwanted leukocytes to characterize CTC in the so-called DEPArrayTM System based on identification and isolation of single cells in an electric field with combined fluorescence microscopy. In addition to "Spike-in"-experiments of tumor cell lines into blood of healthy female subjects, the most successful methodology should be applied to blood samples of metastatic breast and primary ovarian cancer patients.
The combination of the AdnaTest and the CellRaftSystem for subsequent transcriptome analysis of individual CTCs was used in blood samples from metastatic breast and primary ovarian cancer patients as well as healthy subjects. The immunomagnetically labelled tumor cells were isolated from a gel matrix by micromanipulation and mRNA, transcribed into cDNA, and sequenced on the RNA level. Despite a considerably reduced leukocyte count, only a low percentage of the selected CTCs were suitable for sequencing. Tumor patients and healthy subjects showed a heterogeneous gene overexpression. The genes most frequently overexpressed in both tumor entities were assigned to angiogenesis and the cell cycle. To optimize sequencing and to exclude or minimize false positive results, the QIAseqTM UPX3' Transcriptome Kit, containing Unique Molecular Identifiers (UMIs), was used. It allowed subsequent sequencing of almost 90 % of the cells selected from five breast cancer patients, 50 % of the cells selected from 12 ovarian cancer patients and 75 % of the cells selected from five healthy subjects. While healthy subjects mainly expressed pseudogenes, 50 % of the tumor patients showed similarities of the most frequently overexpressed genes, 20 % of which were associated with cellular transport. In summary, the latter approach was very successful in identifying the genes in the respective signaling pathways for further clinical questions.
Furthermore, "Spike-in"-experiments using different devices, were conducted to select CTCs for subsequent DEPArray™ System analysis to further characterize these cells on the genome level. These devices included density gradient centrifugation, an immunodensitivity method for the isolation of CTCs from whole blood, the RosetteSepTM, the comparable MACS®-System, as well as the ParsortixTM System, a microfluidic technology for the isolation of CTCs due to their lower deformability and large size as compared to blood cells. The ParsortixTM System showed poor recovery rates, especially in ovarian cancer cell lines. Despite relatively good results for the other tumor entities, the cell reduction of about 50 % due to the isolation of cells from the device was too high to be used for further investigations. Although density gradient centrifugation showed good recovery rates, it was rather unsuitable for the DEPArrayTM System with limited loading capacity due to an unsuitable large number of contaminating cells, mostly leukocytes. The RosetteSepTM also did not meet the criteria required here despite good enrichment rates. In contrast, the MACS®-System modified in this dissertation with second column run, showed recovery rates of 13-75 % in ovarian and breast cancer cell lines, as well as a 96 % leukocyte depletion. In 10/16 patients with ovarian cancer, subsequent whole genome amplification (WGA) and copy number variations (CNV) analyses were performed for 76 potential CTCs, of which only 2/10 patients had three cells with malignant character. In summary, an effective enrichment of the CTCs could be established; however characterization of CTCs using the DEPArray™ System has to be optimized in order to perform a characterization by sequencing.
Overall, the feasibility of CTC selection for further comprehensive characterization of individual CTCs has nicely been demonstrated in this dissertation and might be promising for future clinical use. However, the methodology not only has to be further optimized but also has to be more cost effective in order to apply it to patients.

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