CDK1-mediated destabilization of astral microtubules is important for spindle positioning

Singh, Divya GND

Beim Übergang der Zellen von der Interphase in die Mitose, koordiniert durch die Cyclin-abhängige Kinase CDK1, müssen diese gleichzeitig ihre Mikrotubuli-basierten Spindeln assemblieren und ausrichten, um die Position der Spaltfurche zu bestimmen. Der Prozess der Spindelorientierung ist für die Zelldifferenzierung und Ausbildung der Gewebestrukturen erforderlich, und Fehler in der Spindelorientierung treten gehäuft bei neurologischen Erkrankungen auf und stehen im Verdacht das Fortschreiten des Tumorwachstums zu fördern. Besonders astrale Mikrotubuli spielen eine wichtige Rolle in der Übersetzung intrazellulärer und extrazellulärer Signale und der Ausrichtung der mitotischen Spindel innerhalb der Zelle. Obwohl astrale Mikrotubuli für die Spindelpositionierung entscheidend sind, verstehen wir bisher nicht, ob und wie ihre Dynamik räumlich und zeitlich reguliert wird. Zuvor konnten wir ein Mikrotubuli-stabilisierendes Protein, GTSE1, identifizieren, das die zeitnahe Chromosomenausrichtung und die Stabilität von astralen Mikrotubuli gewährleistet. GTSE1 interagiert in der Interphase direkt mit dem Plus-Ende wachsender Mikrotubuli, jedoch geht diese spezifische Assoziation während der Mitose verloren. Stattdessen wird GTSE1 durch Wechselwirkung mit Clathrin zum Spindelapparat rekrutiert. Warum verbraucht die Zelle aber Energie, um die Assoziation von GTSE1 mit wachsenden Mikrotubuli-Plus-Enden während der Mitose zu unterbinden, nur um es durch einen anderen Mechanismus wieder zur Spindel zurückzubringen und ist dies wichtig für die Regulierung der Stabilität der astralen Mikrotubuli? In dieser Arbeit zeigen wir, dass GTSE1 über CDK1-abhängigen Verlust der Interaktion mit dem Plus-Ende-verfolgenden Protein EB1 von wachsenden Mikrotubuli-Plus-Enden entfernt wird. In-vitro-Studien zeigen, dass CDK1 GTSE1 direkt phosphoryliert, um dessen Fähigkeit der Plus-Ende-Verfolgung aufzuheben, indem es elektrostatisch anziehende Interaktionen zwischen GTSE1 und EB1 über große Entfernungen verhindert. Eine GTSE1-Phosphomutante, die während der Mitose weiterhin mit den Mikrotubuli-Plus-Enden interagieren kann, verursacht eine anormale Hyperstabilisierung von astralen Mikrotubuli während der Prometaphase, was die Rotation des Spindelapparates während der Prometaphase verlangsamt und in Folge dessen die zellformabhängige Spindelpositionierung entlang der Längsachse stört, ohne die Kondensation der Chromosomen zu beeinflussen. Die beobachtete Stabilisierung astraler Mikrotubuli geht mit einer Abnahme der Häufigkeit von Mikrotubuli-Katastrophen einher. Interessanterweise stabilisiert die GTSE1 Phosphomutante, die weiterhin mit den Plus-Enden von Mikrotubuli interagieren kann, Mikrotubuli in Zellen, denen Clathrin fehlt, da die Stabilität der astralen Mikrotubuli zumindest teilweise durch die Expression der Phosphomutante gewährleistet werden kann. Zusammengenommen liefern unsere Ergebnisse erste Hinweise zur CDK1-Regulation von astralen Mikrotubuli in einem Säugetiersystem durch GTSE1 und zeigen, dass die CDK1-Aktivität zu Beginn der Mitose astrale Mikrotubuli destabilisiert, um eine Neuorientierung der mitotischen Spindel zu ermöglichen.

As cells transition from interphase to mitosis, coordinated by the cyclin-dependent kinase CDK1, they must simultaneously assemble and orient their microtubule-based spindles in order to determine the position of the cleavage furrow. The process of spindle orientation is required for cellular differentiation and tissue patterning, and spindle orientation defects are common to neurological diseases and thought to promote tumor progression. Astral microtubules in particular are important for translating intracellular and extracellular cues and orienting the mitotic spindle within the cell. Although astral microtubules are critical for spindle positioning, we do not understand whether and how their dynamics are spatio-temporally regulated for this process. We previously identified a microtubule-stabilizing protein, GTSE1, that is required for timely chromosome alignment and astral microtubule stability. GTSE1 localizes to growing microtubule plus ends in interphase, but this association is lost in mitosis. Instead GTSE1 is recruited to the spindle via interaction with clathrin. Why does the cell expend energy in preventing association ofGTSE1 growing microtubule plus ends during mitosis, only to bring it back to the spindle via a different mechanism, and is this important for regulating astral microtubule stability? In this thesis, we show that GTSE1 is removed from growing microtubule plus ends in mitosis via CDK1-dependent loss of interaction with the plus end-tracking protein EB1. In vitro studies show that CDK1 directly phosphorylates GTSE1 to abolish its plus end tracking via hindering long-distance electrostatic attractive interactions between GTSE1 and EB1. A GTSE1 phosphomutant that exhibits microtubule plus end association in mitosis causes aberrant hyperstabilization of astral microtubules in prometaphase, prevents spindle rotation in prometaphase, which in turn interferes with cell-shape dependent spindle positioning along the long axis, without affecting chromosome congression. The observed stabilization of astral microtubules is concurrent with a decrease in microtubule catastrophe frequency. Interestingly, the GTSE1 phosphomutant that localizes to microtubule plus ends stabilizes microtubules, at least partly, in a clathrin-independent manner, as expressing the phosphomutant in cells lacking clathrin partially restores astral microtubule stability. Collectively, our study reports the first instance of CDK1 regulation of astral microtubules in a mammalian system, via GTSE1, and uncovers that CDK1 activity at the onset of mitosis destabilizes astral microtubules in order to allow spindle reorientation.

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Singh, Divya: CDK1-mediated destabilization of astral microtubules is important for spindle positioning. 2020.

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