Untersuchung und medikamentöse Modifikation der leukämischen Knochenmarknische bei Kindern mit und ohne Down-Syndrom in der akuten megakaryoblastären Leukämie

Hack, Theresa GND

Trotz umfangreicher Forschung in dem Gebiet der pädiatrischen akuten megakaryoblastären Leukämie (AMKL), ein Subtyp der akuten myeloischen Leukämie (AML), bleibt die Rolle der Knochenmarknische (KMN) in der Leukämogenese unklar. Dennoch lässt das klinische Bild eine zentrale Rolle der KMN in Patienten mit myeloischer Leukämie bei Kindern mit Down-Syndrom (ML-DS) und AMKL – ohne Down-Syndrom – vermuten. Beide Leukämien zeigen ähnliche klinische Verläufe und weisen eine Knochenmarkfibrose (KMF) als Begleiterscheinung auf. Damit stellen die beiden Erkrankungen eine gutes Modell dar, um die leukämische KMN zu charakterisieren sowie neue Therapiemöglichkeiten zu identifizieren. Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind zentrale Bestandteile der KMN und Quelle der KMF. Sie scheinen unter anderem durch Zytokine von Megakaryozyten/Thrombozyten, wie TGFB1, welches den TGFB-Signalweg anspricht, reguliert zu sein. Die isolierten MSCs aus pädiatrischen ML-DS- und AMKL-Patienten sowie Gesundspendern wurden zunächst entsprechend den Kriterien der Internationalen Gesellschaft für Zelltherapie validiert. Anschließend erfolgte eine deskriptive und funktionale Charakterisierung dieser. Die Analyse bestand dabei aus einem in vitro-Profiling und Behandlungsassays, welche durch die Generierung und Charakterisierung einer humanisierten leukämischen KMN aus MSCs in Mäusen ergänzt wurde. Für die ML-DS-MSCs konnte zunächst gezeigt werden, dass diese nicht die pathognomische GATA1-Mutation der leukämischen Blasten aufwiesen. In den Untersuchungen zur adipogenen Differenzierung konnte ein intrinsisch vermindertes Potential in den ML-DS- und AMKL-MSCs identifiziert werden. Die Ergebnisse der Genexpressionsanalysen hingegen wiesen keine globalen Unterschiede zwischen den Entitäten auf. Allerdings konnte das Gen IGF2BP3, welches für ein onkofetales mRNA-bindendes Protein codiert (IF2B3, alias IMP3), als hochgradig überexprimiert in den krankheitsassoziierten MSCs identifiziert werden. IF2B3 ist in vielen Krebsentitäten als hochreguliert beschrieben und scheint im Zusammenhang mit verstärkter Proliferation zu stehen. Dieser Zusammenhang konnte allerdings in den funktionellen Assays dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Es deutet daraufhin, dass IF2B3 unterschiedliche Rollen der Regulation bzw. Modulation einnimmt, abhängig vom jeweiligen Gewebe. Unter TGFB1-Behandlung konnte eine Hemmung der Expression von IGF2BP3 in allen MSCs gezeigt werden. Dies deutet auf einen möglichen regulatorischen Zusammenhang zwischen IGF2BP3 bzw. IF2B3 und dem TGFB-Signalweg. Das Zytokin TGFB1, welches von Megakaryoblasten nachweislich sekretiert wird, konnte das klinische Bild einer KMF im in vitro-Modell der MSCs – verminderte adipogene Differenzierung, gesteigerte Expression von Fibrosemarkern (COL1A1, COL3A1, ACTA2) – abbilden. LIF als weiteres relevantes Zytokin, welches den JAK/STAT-Signalweg anspricht – in unserer Arbeitsgruppe konnten wir in megakaryoblastären Leukämiezelllinien eine um ein vielfaches gesteigerte Expression nachweisen – induzierte ebenfalls eine verminderte adipogene Differenzierung und wird in der Literatur in Kooperation mit TGFB1 als pro-fibrotischer Faktor beschrieben. Der JAK1/2-Inhibitor Ruxolitinib (RUX), welcher bei Erwachsenen in Myeloproliferativen Neoplasien bereits zur Behandlung von Myelofibrose zugelassen ist, induzierte eine verstärkte adipogene sowie eine verminderte osteogene Differenzierung in allen MSC-Entitäten. Womit er dem späten klinischen Bild einer Myelofibrose bzw. KMF – abwesende Adipozyten, Auftreten von Osteosklerose – entgegenwirkt und somit auch in der ML-DS bzw. AMKL eine mögliche Therapieoption darstellen könnte. Die generierte KMN im in vivo-Mausmodell zeigte in der Charakterisierung keine Unterschiede zwischen den aus unterschiedlichen MSC-Entitäten hergestellten Ossicle. Die pathologische Evaluierung bestimmte das erzeugte Xenograftgewebe als Bindegewebsmatrix, hauptsächlich bestehend aus fibroblastischen Zellen (MSCs) und Kapillaren. Nach Einspritzen einer ML-DS-Zelllinie konnte zum einen das Anwachsen der eingebrachten Zellen sowie eine Induktion einer Grad-I und -II-Fibrose in der generierten KMN nachgewiesen werden – unabhängig der MSC-Entität. Somit konnte eine humanisierte leukämische KMN im in vivo-Mausmodell etabliert werden, die das Wachstum leukämischer Megakaryoblasten fördert und zeigt, dass leukämische Megakaryoblasten die Ursache der KMF zu sein scheinen. Die Daten verdeutlichen eindrucksvoll den wechselseitigen Einfluss zwischen leukämischen Megakaryoblasten und MSCs, was zu einer Induktion einer KMF führt – in vitro und in vivo. Interaktionen vermittelt durch den TGFB- und JAK/STAT-Signalweg scheinen eine Schlüsselrolle in der Entwicklung einer leukämischen KMN in der ML-DS und AMKL zu haben. Dieses etablierte Modell bietet damit eine einzigartige Möglichkeit die leukämische KMN weiter zu untersuchen, um anschließend den therapeutischen Nutzen in folgenden Studien – unter anderem die Wirkung von RUX als Therapieoption im in vivo-Modell – zu evaluieren.

Despite extensive research, the function of the bone marrow niche (BMN) in pediatric acute megakaryoblastic leukemia (AMKL) a subtype of acute myeloid leukemia (AML) is still unclear. However, the clinical picture strongly suggests relevant impact of the BMN in patients with myeloid leukemia associated with Down syndrome (ML-DS) and AMKL – patients with euploid genome. Based on similar clinical progressions, bone marrow fibrosis (BMF) occurs as a side-effect of both leukemia subtypes. These two diseases (ML-DS and AMKL) suit as a model to characterize the leukemic BMN and enable the opportunity to identify new targets for therapy. Mesenchymal stromal cells (MSCs) are important members of the BMN, source of MF and seem to be regulated by cytokines of megakaryocytes/platelets, such as TGFB1 targeting the TGFB signaling pathway. At first, the isolated MSCs from ML-DS and AMKL patients as well as healthy donors were validated in accordance with the criteria of the international society for cellular therapy followed by a descriptive and functional characterisation of MSCs. The analysis included in vitro profiling and treatment assays - complemented by the generation and characterisation of a humanized and leukemic BMN in mice. Mutation analysis revealed, that ML-DS-MSCs did not harbour the pathognomic GATA1 mutation of the leukemic blasts. Further, the results showed intrinsic decreased adipogenic differentiation and upregulation of IGF2BP3 – encoding an oncofetal RNA binding protein – in ML-DS- and AMKL-MSCs. IGF2BP3 is described as upregulated in diverse cancer entities and seems to be connected to increased proliferation potential. However, in functional assays this fact could not be confirmed. This suggests that IGF2BP3 has different regulation and modulation roles depending on the respective tissue. Moreover, TGFB1 treatment induced a decreased IGF2BP3 expression in all MSCs. This indicates a regulatory connection between IGF2BP3 and TGFB signaling. The cytokine TGFB1 is known to be secreted by leukemic megakaryoblasts. In the analysis of this thesis, TGFB1 induced a fibrotic state in MSCs regardless of their origin, indicated by decreased adipogenic differentiation potential and increased expression of fibrosis markers (COL1A1, COL3A1, ACTA2). LIF is targeting the JAK/STAT signaling pathway. In cooperation with TGFB1 it is described to react like a profibrotic cytokine. LIF was shown to be highly expressed from megakaryoblastic leukemic cell lines by our working group and also induced a decreased adipogenic differentiation potential. The JAK1/2 inhibitor Ruxolitinib (RUX), which has been already approved as myelofibrosis treatment in adults of myeloproliferative neoplasms, showed increased adipogenic and decreased osteogenic differentiation potential, regardless of the MSC entity. Therefore, RUX shows the opposite reaction of the late clinical picture in myelofibrosis and BMF, respectively – absent adipocytes, occurrence of osteosclerosis. This indicates a possible treatment option for RUX in ML-DS and AMKL. The generated BMN of the in vivo mouse model showed no differences between the ossicle generated from different MSC entities.The pathological evaluation defined the generated xenograft tissue as connective tissue matrix consisting of fibroblastic cells (MSCs) and capillaries. After injection of ML-DS cell line into the generated BMN, injected cells grew out and induced fibrosis of grade I and II, regardless of the MSC entity. Therefore, a humanized leukemic BMN of a in vivo mouse model could be established. It supports the growth of leukemic megakaryoblasts and suggests the leukemic megakaryoblasts as presumed origin of the BMF. The data impressively illustrate the mutual influence of leukemic megakaryoblasts and MSCs that leads to induction of BMF – in vitro and in vivo. Interaction mediated by TGFB and JAK/STAT pathway seems to be key factors for development of leukemic BMN in ML-DS and AMKL. This established model – in vitro and in vivo – offers a unique opportunity to fundamentally examine the leukemic BMN in order to subsequently evaluate the therapeutic use in further studies, especially the effect of Ruxolitinib as therapy option in the in vivo mouse model.

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Hack, Theresa: Untersuchung und medikamentöse Modifikation der leukämischen Knochenmarknische bei Kindern mit und ohne Down-Syndrom in der akuten megakaryoblastären Leukämie. 2020.

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