Development of a nanoLC-MS system for global lipidomics

In the context of this thesis, an advanced nano-flow liquid chromatography (nLC) – nanoelectrospray (NSI) - mass spectrometry (MS) system was developed for a global (i.e. not lipid class- or species-restricted) lipidomics approach. In order to grant broad range analyses of different lipid classes and species, the loading- and sample preparation procedures were particularly optimized. A direct sample injection with the resuspension mixture of BuOH:IPA:H2O 8:23:69 + 5 mM phosphoric acid (8Bu+) thereby proved to be suitable for global lipidomics experiments. In this regard, the addition of phosphoric acid to the samples strongly enhanced the general detectability of lipids with terminal phosphate groups, which were found to be hardly analyzable under standard reversed-phase LC conditions. The robustness of the nLC-MS method was then evaluated based on repetitive analyses of a yeast extract that was spiked with standards. Over a measuring period of two days, high retention time stabilities were achieved for all analyzed lipids. The bulk of phospholipids could be stably detected with relative standard deviations below 10 %, while the MS-response was less stable for late eluting very hydrophobic lipids. Using normalization approaches, these deviations could nevertheless be reduced with structurally- or retention time-related standards. A direct sensitivity comparison to a corresponding narrow-bore HPLC platform revealed an increase of 2-3 orders of magnitude for the MS response by application of the nLC system that conformed with an increase of up to two orders of magnitude for the linear dynamic range. Sub-femtomol traces of individual lipids (< nM concentrations) could thus be detected with the nLC-MS platform in both positive and negative mode analyses. In order to permit a thorough comparison of the lipidome coverage, a semi-autonomous workflow was developed that allowed an accurate identification of individual (molecular) lipid species. The presumably simple yeast (Saccharomyces cerevisiae) lipidome was then selected as a model for the in-deep evaluation of the lipidome coverage. The direct comparison of the yeast phospholipidome to the corresponding narrow-bore HPLC revealed a more than three-fold increase in lipid identifications on molecular species level when identical sample concentrations were comparatively analyzed with both LC systems. All in all, 935 lipid species, with each comprising multiple molecular species isomers, were identified across 30 analyzed lipid classes from 4 lipid categories in yeast. Even though this thesis uncovered more endogenous yeast lipids than any reference study, a detailed analyses of isomeric signals further indicates that also novel lipid classes, such as headgroup-methylated PS variants, and oxidized lipids can be found in natural yeast lipid extracts. Overall, this thesis shows that the insights into the complexity of a lipidome can be strongly deepened by using an nLC-MS system for a global lipidomics experiments.

In dieser Arbeit wurde ein Nano-Fluss-Flüssigkeitschromatographie (nLC) - Nanoelektrospray (NSI) - Massenspektrometrie (MS) System für eine globale (nicht Lipidklassen oder Lipidspezies beschränkte) Lipidomanalytik entwickelt. Um eine gute chromatographische Trennung von einzelnen Lipidspezies bei direkter Probeninjektion zu ermöglichen, musste die Probenresuspensionslösung zunächst optimiert werden. Eine Mischung aus BuOH:IPA:H2O 8:23:69 + 5 mM Phosphorsäure (8Bu+) erwies sich dabei als geeignet, um eine große Anzahl verschiedener Lipidstandards, die die natürliche Diversität eines Extraktes wiederspiegeln, sauber chromatographisch zu trennen. Der Zusatz von Phosphorsäure zu den Proben steigerte dabei maßgeblich die Detektionsfähigkeit von Lipiden mit terminalen Phosphatgruppen, die unter Standardbedingungen schlecht detektierbar sind. Die Robustheit der nLC Methode wurde anhand repetitiven Analysen eines Hefeextraktes, welches mit Lipidstandards versetzt wurde, evaluiert. Über eine zweitägige Messperiode wurde dabei eine hohe Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten festgestellt. Während Phospholipide mit relativen Standardabweichungen von unter 10 % detektiert werden konnten, war die Detektionsstabilität besonders für sehr hydrophobe und spät eluirende Lipide geringer. Durch klassen- oder retentionszeitspezifische Normalisierungen mit Lipidstandards konnten diese Schwankungen nichtsdestotrotz reduziert werden. Im direkten Sensitivitätsvergleich zu einem vergleichbaren narrow-bore HPLC System wurde ein Anstieg von 2-3 Größenordnungen für die MS-Sensitivität (Detektorantwort) bei einer nLC-Kopplung ermittelt. Dieser ging mit einer Zunahme von bis zu zwei Größenordnungen für den linearen Messbereich einher und ermöglichte die nLC- basierende Detektion von sub-femtomol Lipidmengen (< nM Konzentrationen) sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus. Um einen gründlichen Vergleich der Lipidomabedeckung zu gewährleisten („wie viele Lipide können wir identifizieren“), wurde ein halbautonomer Arbeitsablauf entwickelt, der die akkurate Identifizierung einzelner (molekularer) Lipidspezies im Hefelipidom ermöglichte. In der direkten Gegenüberstellung zu dem vergleichbaren HPLC System konnten durch den Einsatz des nLC Systems 343 % mehr molekulare Lipidspezies bei gleicher Probenkonzentration im Phospholipidom der Hefe identifiziert werden. Insgesamt wurden 935 Lipidspezies (die jeweils verschiedene Isomere beinhalten) in über 30 Lipidklassen von 4 Lipidkategorien im Hefelipidom bestimmt. Obwohl diese Arbeit mehr endogene Hefelipide als jede Referenzstudie aufdeckte, deuten detaillierte Analysen von isomeren Signalen darauf hin, dass auch neuartige Lipidklassen wie kopfgruppenmethylierte PS-Varianten oder oxidierte Lipide in natürlichen Hefelipidextrakten gefunden werden können. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass der Einblick in die Komplexität eines Lipidoms mit einer hochempfindlichen nLC-basierenden Lipidanalyse erheblich vertieft werden kann.

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Danne-Rasche, N., 2021. Development of a nanoLC-MS system for global lipidomics. https://doi.org/10.17185/duepublico/71520
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