Function of the TFIIB homologs TFB2 and TFB3 as alternative general transcription factors in Sulfolobus acidocaldarius
Der basale Transkriptionsapparat der Archaeen ähnelt hinsichtlich der RNA-PolymeraseUntereinheiten, der Promotorarchitektur und der Funktion stark dem eukaryotischen RNAPolymerase-II-System (RNAP-II-System). Während bei den Eukaryoten drei verschiedene RNA-Polymerasen (RNAP 1-3) die Herstellung unterschiedlicher RNA-Typen katalysieren, verfügen Archaeen über eine RNA-Polymerase, die diese Funktion für alle Klassen von RNAs übernimmt. Archaeen besitzen darüber hinaus Homologe der eukaryotischen generellen Transkriptionsfaktoren (GTF) TATA-Box-Bindeprotein (TBP), Transkriptionsfaktor IIB (TFIIB) und Transkriptionsfaktor IIE (TFIIE), welche als TBP, TFB und TFE bezeichnet werden. Die grundlegenden Mechanismen der Transkriptionsinitiation bei Archaeen sind weitgehend bekannt. Kurz zusammengefasst, bindet TBP zunächst an die TATA-Box, bevor TFB folgt und den Komplex mittels Bindung an TBP sowie sequenzspezifischer Kontakte zum „TFB
recognition element“ (BRE) der DNA stabilisiert. Schließlich rekrutiert TFB die RNAPolymerase (RNAP), was zur Bildung des minimalen Präinitiationskomplexes (PIC) führt. Während der Evolution der Archaeen haben sich bei vielen Arten multiple Paraloge, insbesondere von TBP und TFB, entwickelt. Studien haben gezeigt, dass solche alternativen GTF eine wichtige Rolle in der Stressantwort sowie bei der Reaktion auf sich schnell verändernde Umweltbedingungen spielen. Diese Ergebnisse werden unter anderem dadurch unterstützt, dass für TFB sowie das eukaryotische TFIIB in einer aktuellen Arbeit Homologie zu bakteriellen σ-Faktoren vorgeschlagen wurden.
Während die Funktionen alternativer GTF in Euryarchaeen bereits untersucht wurden, ist das entsprechende Wissen über Crenarchaeen derzeit sehr begrenzt. Sulfolobus acidocaldarius ist ein thermoacidophiles Crenarchaeon, dessen Genom ein TBP und drei TFBs (TFB1-3) kodiert. Während TFB1 als das klassische „Housekeeping“-TFB angesehen wird, werden für TFB2 und TFB3 spezifische Funktionen angenommen. Das Ziel dieser Arbeit war es, mögliche Funktionen von TFB2 und TFB3 zu untersuchen und mit Hilfe unterschiedlicher molekularbiologischer, biochemischer, und genetischer Methoden sowie genomweiter Transkriptomanalysen neue Erkenntnisse über deren Rolle bei der Transkriptionsregulation und über mögliche Wirkungsmechanismen zu gewinnen.
In Kapitel I geht es um die Rolle von TFB2 bei der Regulation des Zellzyklus von S. acidocaldarius sowie um mögliche Effekte auf die Transkription in Crenarchaeen. Ein Vergleich der Proteinmengen von C-terminal genomisch Strep-/FLAG-markierten GTF hat gezeigt, dass unter Standardwachstumsbedingungen TFB1, TFEα, TFB2, TFB3 und TFEβ in etwa 6-, 7-, 29-, 37- bzw. 52-fach geringerer Menge vorliegt als TBP. Die Immunodetektion von TFB2 in Extrakten aus Zellzyklus-synchronisierten Zellen hat ergeben, dass während des Übergangs zwischen G1- und S-Phase, in dem die DNA-Replikation vorbereitet wird, die Proteinmenge besonders hoch ist. Die zyklische Induktion konnte mittels qRT-PCR bestätigt werden und ist im Einklang mit einer vorherigen Studie. Die biologische Aktivität der der rekombinant hergestellten GTF wurde mittels EMSAs durch die Beobachtung der erwarteten DNA-TBP-TFB1- sowie DNA-TBP-TFB1-RNAP-Komplexe nachgewiesen. Dabei zeigte TFB2 allein keine Bindung an die DNA-Probe und es war nicht möglich, TFB1 als essentiellen GTF durch TFB2 zu ersetzen. Durch den Einsatz eines modifizierten Systems mit weniger stringenten Pufferbedingungen wurde der Nachweis eines stabilen TBP-DNA-Komplexes erreicht. In Folgeexperimenten wurde deutlich, dass TFB2 in hohen Konzentrationen negative Effekte auf die Bildung des TBP-DNA-Komplexes hat und dazu in der Lage ist, die
Transkription des SSV-T6-Promoters in vitro zu inhibieren. Durch Einzelmolekül-FRETMessungen konnten wir zeigen, dass TFB2 die Biegung der Promotor-DNA konzentrationsabhängig reduziert. Die Tatsache, dass diese Eigenschaft auch auf TtxTFB2 im Thermoproteus tenax System mit TtxTBP und TtxTFB1 zutrifft, deutet darauf hin, dass sich die Funktion von TFB2 in Crenarchaeen von der des euryarchaealen TFB2 unterscheidet, zumal in mehreren Studien gezeigt wurde, dass TFB2 in Euryarchaeen die Rolle von TFB1 in der Transkriptionsinitiation, wenn auch mit geringerer Effizienz, übernehmen kann. Der zeitgleiche Ablauf der DNA-Replikation und der Transkription birgt die Gefahr von Konflikten zwischen den beiden Maschinerien. Experimente mit B. subtilis haben gezeigt, dass unter Bedingungen, bei denen die Transkription gehemmt ist, die Replikationskomplexe eine längere Lebensdauer und das Replisom eine höhere Stabilität aufweisen. Wir vermuten, dass TFB2 eine wichtige Rolle in der Regulation des Zellzyklus spielt, indem es bei entsprechender zellulärer Konzentration die Transkription während der G1/S-Phase inhibiert, wodurch der Zelle die Möglichkeit gegeben wird, ihre Energie für andere Prozesse, insbesondere die DNAReplikation, aufzuwenden.
Kapitel II beschäftigt sich mit den Auswirkungen von UV-Bestrahlung auf S. acidocaldarius
sowie mit der Frage, welche Rolle TFB3 bei der frühen Stressantwort in Folge von UVBestrahlung spielt. Mittels Immunodetektion von C-terminal mit einem Strep-/FLAG-Tag genomisch markiertem TFB3 in Gesamtproteinextrakten aus dem Stamm tfb3CSF sowie auf dem lacS Reportergen-Test basierender Promotoraktivitätsstudien konnten wir zeigen, dass TFB3/tfb3 90 min nach UV-Behandlung der Zellen verglichen mit der unbehandelten Kontrolle sowohl auf Protein- als auch auf Genebene signifikant induziert wird. Die auf vorherige in vitro Experimente gestützte Annahme, dass TFB3 mit dem Komplex aus DNA, TBP und TFB1 sowie mit dem vollständigen PIC interagiert, konnte durch Co-Immunpräzipitation von TFB3 mit TFB1 und RNAP in vivo bestätigt werden. Die Expression der ups (UV inducible pili operon of Sulfolobus) Pili, welche die Bildung großer Zellaggregate und den Austausch von DNA zwischen Zellen erlauben, sowie der Gene des ced (crenarchaeal system for exchange of DNA) DNA-Importers, gehören zu den wichtigsten Antworten von S. acidocaldarius auf UV-tress. Um die Auswirkungen der Abwesenheit von TFB3 auf die Transkription zu untersuchen, wurde die Insertionsmutante tfb3::pyrEF hergestellt. Es zeigte sich, dass die Zellaggregation in diesem Stamm im Vergleich zum Referenzstamm MW001pyrEF+ nahezu vollständig unterdrückt wurde. Mittels qRT-PCR wurde bestätigt, dass die ups- und cedB-Gene in der TFB3-Mutante stark herunterreguliert waren. Somit konnten wir zeigen, dass TFB3 an der Regulation dieser Gene und damit an der Ausbildung der entsprechenden Strukturen sowie der Zellaggregation beteiligt ist. Um weitere Effekte von TFB3 auf die Transkription während der frühen UV-Antwort zu untersuchen, wurde eine umfassende Transkriptomanalyse mit tfb3::pyrEF und MW001pyrEF+ durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass sich eine TFB3-abhängige und eine TFB3-unabhängige Antwort unterscheiden lassen. Bei der TFB3-abhängigen Reaktion kommt es zu einer raschen Induktion von TFB3, bevor die Transkription der TFB3-abhängigen Zielgene, darunter das ups Operon und Gene des ced DNA-Importers, zeitverzögert ansteigt. Unsere Beobachtungen bestätigen die Hypothese, dass es sich bei TFB3 um einen Transkriptionsaktivator handelt. Bei der TFB3-unabhängigen UV-Antwort wird die DNA-Replikation und das Fortschreiten des Zellzyklus inhibiert sowie die
Biosynthese von Nukleotiden heruntergefahren, um TFB3-abhängige DNAReparaturmechanismen zu ermöglichen.
In Kapitel III wurde FadRSa, ein Transkriptionsfaktor der TetR-Familie in S. acidocaldarius, charakterisiert sowie dessen Bedeutung für den Fettsäuremetabolismus aufgezeigt. In Archaeen wird die Regulation der Transkription überwiegend durch Transkriptionsfaktoren, die denen der Bakterien ähneln, kontrolliert. Diese können als Repressoren (z.B. LrpA aus Pyrococcus furiosus) oder Aktivatoren (z.B. Ss-LrpB aus S. solfataricus) fungieren. Anders als bei bakteriellen und eukaryotischen Zytoplasmamembranen, deren Kohlenwasserstoffketten aus Fettsäureestern (Glycerin-3-Phosphat) besteht, enthält die Zellmembran der Archaeen Isoprenoidketten, die über eine Etherbindung mit dem Glycerin-1-Phosphat verknüpft sind. Dennoch kommen Fettsäuren in Archaeen vor und es wird angenommen, dass sie an der Acylierung und Stabilisierung von Membranproteinen wie z.B. Rhodopsin beteiligt sind. Die Regulation des Fettsäurestoffwechsels in Archaeen ist weitgehend unerforscht. Kristallographische Analysen ergaben, dass FadRSa den bakteriellen TetR-ähnlichen FadRRegulatoren strukturell ähnelt. FadRSa liegt als Homodimer vor, wobei jede Untereinheit zwei funktionelle Domänen aufweist: Das N-terminale Helix-turn-helix (HTH) als DNA-Bindemotiv sowie ein C-terminaler Bereich, der für die Stabilisierung und Dimerisierung benötigt wird. Die zufällige Ko-Kristallisation mit Acyl-CoA-Molekülen aus dem Expressionswirt Escherichia coli weist darauf hin, dass es sich bei Acyl-CoA um einen spezifischen Liganden von FadRSa handeln könnte. Bei der Untersuchung der genomweiten DNA-Interaktion mittels ChromatinImmunpräzipitation kombiniert mit Next Generation Sequencing (ChIP-seq) wurden vier signifikante Bindestellen entdeckt, die sich alle innerhalb eines großen Genclusters befinden Dieses erstreckt sich über die Gene Saci_1103 bis Saci_1126 und beinhaltet unter anderem Homologe der drei β-Oxidationsenzyme Acyl-CoA-Dehydrogenase, Enoyl-CoA-Hydratase und Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase sowie einige Vertreter der Thiolasen. Die Verifizierung der Bindestellen erfolgte mittels ChIP-qPCR und weiteren Experimenten mit einer fadRSaDeletionsmutante. Die Bindung an die spezifischen DNA-Sequenzen wurde darüber hinaus in EMSAs mit gereinigtem FadRSa und mutiertem FadRSa gezeigt. Die Bindung an die Operatorsequenz der potentiellen Esterase Saci_1123 erfolgt als einzelnes Dimer, während sich für die Interaktion mit fadRSa (Autoregulation) zwei Stöchiometrien mit zwei unterschiedlichen Protein-DNA-Komplexen ergeben.
Bei einer Transkriptomanalyse zeigten in der fadRSa-Deletionsmutante 13 Gene eine differentielle Expression. Alle Gene befinden sich innerhalb des Saci_1103-Saci_1126 Genclusters, der Gene für eine vollständige β-Oxidation zum Abbau von Fettsäuren enthält. Aus der Tatsache, dass auch alle anderen Gene in diesem Abschnitt leicht hochreguliert waren, schließen wir, dass es sich bei FadRSa um einen Repressor des kompletten Clusters handelt. Schließlich konnten wir zeigen, dass FadRSa sensitiv auf Acyl-CoA-Moleküle reagiert und Acyl-CoA die Destabilisierung der FadRSa-DNA-Komplexe bewirkt. Die Beobachtung, dass Acyl-CoA in vitro eine Induktion des Genclusters bewirkte, unterstützt die Hypothese, dass es in vivo zu einer De-Repression führt und damit der hemmenden Eigenschaft von FadRSa entgegenwirkt.
In Archaea the basal transcription machinery is closely related to the eukaryotic counterpart, resembling the RNA polymerase II (RNAP II) system in subunit composition, promoter architecture and function. Contrary to eukaryotes, archaea rely on one RNAP for the transcription of all classes of RNA. Furthermore, they encode homologs of the eukaryotic general transcription factors (GTFs) TATA box binding protein (TBP), transcription factor IIB (TFIIB), and transcription factor IIE (TFIIE), called TBP, TFB and TFE, respectively. The basal mechanism of transcription initiation is well investigated. Briefly, TBP binds to the TATA box of the promoter DNA before TFB interacts with TBP and makes a sequence specific contact with the TFB recognition element (BRE). Subsequently, RNAP is recruited by TFB to form the minimal pre-initiation complex (PIC). Many archaeal species have evolved multiple paralogs of the GTFs, especially TBP and TFB. For alternative GTFs, major functions in the response to environmental changes and stress response have been postulated and a recent study suggests that archaeal TFB, eukaryotic TFIIB and bacterial σ factors are homologs. While many studies on the role of alternative GTFs in Euryarchaeota are available, the knowledge about possible functions in the crenarchaeal branch is still rudimental. The genome of the thermocacidopilic crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius encodes one TBP and three TFBs (TFB1-3). While TFB1 is considered the classical housekeeping TFB, specified functions are assumed for TFB2 and TFB3. One aim of this work was to investigate the functions of TFB2 and TFB3 and to gain insights into their role in transcription regulation and their possible mode of action by using different molecular biological, biochemical, genetic as well as genome-wide transcriptomic approaches.
In Chapter I, we studied the role of TFB2 on cell cycle regulation in S. acidocaldarius and explored possible effects of TFB2 on transcription in Crenarchaeota. Using immunodetection of the C-terminal in genome Strep-/FLAG-tagged GTFs we showed that the protein expression of TFB1, TFEα, TFB2, TFB3 and TFEβ under standard growth conditions is approximately 6, 7, 29, 37 and 52 times lower, respectively, compared to the expression of TBP, supporting the idea of TBP and TFB1 being the basal housekeeping GTFs, while the other GTFs are dedicated to specialized functions. Immunodetection of TFB2 in extracts from cell cycle synchronized tfb2CSF cells showed that TFB2 is induced in the G1/S-phase transition, where DNA replication is prepared. Additional qRT-PCR experiments confirmed the cyclic induction at gene level in accordance with previous transcriptome studies. Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) with recombinant GTFs resulted in the formation of the expected DNA-TBPTFB1 and DNA-TBP-TFB1-RNAP complexes, confirming the activity of the purified proteins. TFB2 alone did not bind to the DNA and was not able to replace TFB1 for complex formation. Using a modified buffer system with less stringent conditions a TBP-DNA complex was formed, which allowed to study the effect of TFB2. We demonstrated that TFB2 at high concentrations has the ability to specifically disrupt TBP-DNA complexes. Accordingly, in vitro transcription from the SSV T6 promoter could be inhibited by adding high amounts of TFB2. In singlemolecule Förster resonance energy transfer (FRET) measurements, a concentration dependent reduction of the promoter DNA bending by TFB2 was observed. Using the purified GTFs TtxTBP, TtxTFB1 and TtxTFB2 from the crenarchaeote Thermoproteus tenax we showed that the promoter DNA bending is also inhibited by TtxTFB2, leading to the conclusion that TFB2 in Creanarchaeota could have different functions than in Euryarchaeota. For the latter it was shown that TFB2 can replace TFB1 and is able to initiate transcription, even though with less efficiency. Simultaneous DNA replication and transcription is prone to conflicts between the two machineries and experiments with B. subtilis showed that the lifetime of the replication complexes and the stability of the replisome is increased under conditions where transcription is inhibited. We propose that crenarchaeal TFB2, if present in the appropriate concentration, is able to downregulate transcription during the G1/S-phase of the cell cycle in order to save energy and to allow focusing on DNA replication.
In Chapter II, we investigated the effect of UV irradiation on S. acidocaldarius cells as well as the involvement of TFB3 in the early UV stress response. Using immunodetection of TFB3 in cell extracts from the C-terminal in genome Strep-/FLAG-tagged strain tfb3CSF and promoter activity tests harnessing the lacS based reporter gene assay, we demonstrated that TFB3/tfb3 is significantly induced both on protein and gene level after 90 min of UV treatment compared to untreated cells. We showed the interaction of TFB3 with TFB1 and RNAP in vivo by coimmunopreciptation and thereby confirmed previous in vitro studies where association of TFB3 with the ternary complex of DNA-TBP-TFB1 as well as with the completely assembled PIC was observed. Upon UV stress, cells express ups pili (UV inducible pili operon of Sulfolobus), which promote the formation of large cell aggregates and DNA exchange as well as genes, which encode the ced (crenarchaeal system for exchange of DNA) DNA importer. Aggregation was almost completely abolished in the tfb3 disruption mutant tfb3::pyrEF compared to the reference strain MW001pyrEF+. Furthermore, the qRT-PCR results for the ups genes and cedB showed that the expression of these genes was dramatically decreased in the tfb3 insertion mutant, suggesting that TFB3 is involved in cellular aggregation and in the regulation of the ups and ced genes. To further investigate the effects of TFB3 on transcription in early UV response, we studied tfb3::pyrEF and MW001pyrEF+ by a genome wide transcriptome analysis. The results show that several genes are regulated either in a TFB3-dependent or in a TFB3- independent manner. The TFB3-dependent response is characterized by the rapid upregulation of tfb3 followed by a delayed induction of the tfb3-dependent target genes, which include the ups operon and the ced genes. Thereby we confirmed the suggestion that TFB3 acts as an activator of transcription. Apart from this response, the regulation of other UV-induced or -repressed genes does not depend on the presence of TFB3. This TFB3- independent response includes the repression of DNA replication and cell cycle progression as well as the inhibition of nucleotide biosynthesis in order to allow DNA damage repair mechanisms mediated by the described TFB3-dependent features.
In Chapter III, we characterized a TetR-family transcription factor in S. acidocaldarius called FadRSa and demonstrated its role the metabolism of fatty acids.
In archaea, transcription regulation is predominately controlled by bacterial-like transcription factors, which either act as repressors (e.g. LrpA from Pyrococcus furiosus) or activators (e.g. Ss-LrpB from S. solfataricus). In contrast to bacterial and eukaryotic cytoplasmic membranes, the hydrocarbon chain of the archaeal cell membrane contains ether-linked isoprenoid units instead of ester-linked fatty acids. Nevertheless, fatty acids are present in the archaeal cell and it has been suggested that these are involved in the acylation or stabilization of membranebound proteins like rhodopsin. The pathways, which regulate fatty acid metabolism in archaea, are largely unexplored.
Crystallographic analysis of FadRSa revealed structural similarities with bacterial TetR-like FadR regulators. FadR represents a homodimer with each subunit consisting of two functional domains: The N-terminal helix-turn-helix (HTH) DNA binding motif and the C-terminal domain, which is important for dimer stabilization. Unintended co-crystallization with acyl-CoA derived from the expression host Escherichia coli suggests that acyl-CoA is a specific ligand for FadRSa. Analysis of the genome-wide DNA-interaction using chromatin-immunoprecipitation (ChIP) in combination with next-generation sequencing (ChIP-seq) showed that the four highest enrichments were observed within a an extensive gene cluster, comprising genes Saci_1103 until Saci_1126, encoding homologs of the three β-oxidation enzymes acyl-CoA dehydrogenase, enoyl-CoA hydratase and hydroxyacyl-CoA dehydrogenase as well as members of the thiolase superfamily. Interaction with the specific sequences was validated in vitro using EMSAs with purified FadRSa and mutated FadRSa. Binding to the operator of the putative esterase encoding gene Saci_1123 occurs as a single dimer, while the FadRSa-fadRSa complex (autoregulation) shows two distinct stoichiometries with two protein-DNA-complexes. In a transcriptome analysis we showed that in the fadRSa deletion mutant 13 genes are differentially expressed, which all belong to the Saci_1103-Saci_1126 gene cluster. Since all other genes of the cluster appeared to be slightly upregulated in the mutant strain as well, we conclude that FadRSa is a repressor of the entire gene cluster, which is predicted to harbor genes for a complete β-oxidation pathway. Finally, our finding that FadRSa is responsive to acyl-CoA molecules that cause destabilization of FadRSa-DNA complexes and act as inducers in vitro, supports the hypothesis that intracellular acyl-CoA causes a derepression and thus higher transcriptional activity of the gene cluster in vivo