A systematic proteomic approach to the VCP/p97-cofactor interaction landscape reveals p97 functions in stress response signaling

Hülsmann, Julia GND

The ubiquitin-directed AAA+ ATPase VCP/p97 facilitates degradation of proteins in diverse cellular pathways, including ER-associated degradation, DNA damage response, ribosomal quality control, transcription factor activation, signaling, autophagy and apoptosis. To fulfil its functions in these different pathways, p97 forms alternative multiprotein complexes with distinct sets of adapter proteins and substrate processing cofactors. However, how p97 cooperates with this host of cofactor proteins, the exact composition of cofactor complexes and whether this determines functional specificity remains poorly understood from a biological as well as mechanistic perspective. In this study, we used a systematic proteomic approach to shed light on the p97-cofactor system and its targets. We generated isogenic HEK293 cell lines inducibly expressing individual p97 cofactors. From these cell lines, affinity purifications (APs) of 23 cofactor proteins were performed in parallel, followed by data-independent quantitative SWATH mass spectrometry (SWATH-MS) to identify associated proteins. With our approach, we were able to confirm basic principles of cofactor complex assembly represented by core complexes of mutually exclusive major substrate adapters, which are complemented by accessory cofactors. Accessory modulators, like deubiquitinating enzymes, were identified to bind several core complexes whereas targeting factors such as membrane proteins recruit cofactor complexes to a specific cellular site or organelle. From our findings, we propose that cofactor complex assembly might be based on mechanistic requirements for specialized regulations rather than on specific biological pathways. However, the unexpected complexity of p97-cofactor interactions could be the result of an exceptionally high dynamic within the system. Nevertheless, our MS analysis identified numerous known and novel interacting proteins and allowed us to arrange distinct cofactors into functional modules together with specific sets of additional interactors. In a related proteomic approach, we combined AP-SWATH with the use of a substrate-trapping p97-E578Q mutant to `freeze´ dynamic interactions and identify regulatory interactors together with low-abundant substrate proteins. Isolations of p97-WT and p97-EQ revealed a total of 108 high-confidence interacting proteins over a large detection range. Among them, a subset of p97 cofactors, individual ligases and several pathway-specific factors were trapped in p97-EQ complexes. Of note, the analysis discovered novel p97 substrate candidates of which we selected the eIF2α-specific PP1 regulator CReP/PPP1R15B for further investigation. We demonstrated that the complex of p97-Ufd1-Npl4 facilitates rapid CReP turnover to balance CReP protein levels under physiological conditions. Moreover, we showed that p97 also mediates the quantitative degradation of CReP upon stress induction. By this, p97 enforces eIF2α phosphorylation mediated by stress-kinases, which attenuates translation. Thus, p97 has a dual role in maintaining cellular homeostasis ensuring bulk degradation of misfolded proteins and protective signaling of the integrated stress response.

Die Ubiquitin-gesteuerte AAA+ ATPase VCP/p97 ermöglicht den Abbau von Proteinen in verschiedenen zellulären Prozessen, dazu gehören ER-assoziierte Degradation, DNA-Schadensantwort, ribosomale Qualitätskontrolle, Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, Signaltransduktion, Autophagie und Apoptose. Um diese verschiedenen Funktionen zu erfüllen, bildet p97 alternative Multiproteinkomplexe mit einer unterschiedlichen Zusammensetzung an Adapterproteinen und Substrat-modulierenden Kofaktoren. Wie p97 mit dieser Vielzahl von Kofaktorproteinen zusammenwirkt, die genaue Zusammensetzung der Kofaktorkomplexe und ob diese die funktionelle Spezifität bestimmen, ist aus biologischer und mechanistischer Sichtweise kaum verstanden. In dieser Studie verwendeten wir einen systematischen, proteomischen Ansatz, um Aufschluss zu geben über das p97-Kofaktorsystem und seine Substrate. Wir generierten isogene HEK293-Zelllinien, die einzelne p97-Kofaktoren induzierbar exprimieren. Aus diesen Zelllinien wurden Affinitätsaufreinigungen (APs) von 23 Kofaktorproteinen durchgeführt, gefolgt von einer datenunabhängigen, quantitativen SWATH-Massenspektrometrie Analyse (SWATH-MS), um assoziierte Proteine zu identifizieren. Mit unserem Ansatz konnten wir die grundlegenden Prinzipien der Formation von Kofaktorkomplexen bestätigen. Diese liegen in der Bildung von Kernkomplexen bestehend aus sich gegenseitig ausschließender Hauptadaptoren, welche durch Bindung von akzessorischen Kofaktoren ergänzt werden. Es wurde festgestellt, dass akzessorische Modulatoren, wie deubiquitinierende Enzyme, an verschiedene Kernkomplexe binden, während gerichtete Faktoren, wie beispielsweise Membranproteine, Kofaktorkomplexe an eine bestimmte zelluläre Lokalisation oder Organelle rekrutieren. Basierend auf unseren Ergebnissen nehmen wir an, dass die Zusammensetzung von Kofaktorkomplexen eher auf mechanistischen Erfordernissen für spezialisierte Regulationen basiert als auf spezifischen biologischen Prozessen. Die unerwartete Komplexität von p97-Kofaktor-Interaktionen kann ebenso das Ergebnis einer außergewöhnlich hohen Dynamik innerhalb des Systems sein. Unsere MS-Analyse identifizierte zahlreiche bekannte und unbekannte Interaktoren und ermöglichte es uns, verschiedene Kofaktoren gemeinsam mit zusätzlichen Interaktoren in Funktionsmodule einzuordnen. In einem methodischverwandten, proteomischen Ansatz kombinierten wir AP-SWATH mit der Verwendung einer `Substrat-Trapping-Mutante´, p97-E578Q, um dynamische Interaktionen einzufrieren und regulatorische Interaktoren zusammen mit niedrig abundanten Substratproteinen zu identifizieren. Die Isolationen von p97-WT und p97-EQ brachten insgesamt 108 valide Interaktoren über einen großen Detektionsbereich hervor. Unter diesen waren eine Reihe von p97-Kofaktoren, einzelne Ligasen und Prozess-spezifische Proteine, die in p97-EQ-Komplexen angereichert wurden. Insbesondere konnten bei der Analyse neue p97-Substratkandidaten gefunden werden, von denen wir den eIF2α-spezifischen PP1-Regulator CReP/PPP1R15B zur weiteren Untersuchung ausgewählt haben. Wir konnten vorweisen, dass der Komplex aus p97-Ufd1-Npl4 einen schnellen CReP Abbau ermöglicht, um CReP-Proteinlevels unter physiologischen Bedingungen zu balancieren. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass p97 auch den quantitativen Abbau von CReP bei Stressinduktion vermittelt. Auf diese Weise verstärkt p97 die eIF2α-Phosphorylierung, herbeigeführt durch Stresskinasen, welche die Translation herabsetzt. p97 spielt somit eine duale Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase: es gewährleistet den massiven Abbau von missgefalteten Proteinen und reguliert die protektive Signaltransduktion der integrierten Stressantwort.

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Hülsmann, Julia: A systematic proteomic approach to the VCP/p97-cofactor interaction landscape reveals p97 functions in stress response signaling. 2020.

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