Die korrekte Trennung der Chromosomen ist von entscheidender Bedeutung für die Zellteilung. Während der Metaphase ordnen sich die Chromosomen in der Äquatorialebene an, in der darauffolgenden Anaphase werden die Schwesterchromatiden in Richtung der gegenüberliegenden Spindelpole auseinandergezogen. Fehler während der Trennung können beispielsweise zu Anaploidie führen, bei der die Tochterzellen eine unreguläre Anzahl an Chromosomen erhalten. Jede Chromatide wird durch einen Spindelmikrotubulus festgehalten, vermittelt durch eine Kinetochor genannte Struktur. Die grundlegende Architektur der Kinetochore ist in Eukaryoten konserviert. Ein einfaches Modell, deren Eigenschaften zu untersuchen ist Saccharomyces cerevisiae, in dem eine einfache Kopie des Kinetochors an einem Mikrotubulus hängt, während Kinetochore in höheren Organismen multiple Bindungsstellen aufweisen. Es wird vermutet, dass einzelne Kinetochore in anderen Pilzen und Multizellulären Organismen aus mehreren Kopien von Einheiten der Kinetochore von S. cerevisiae bestehen. Das Kinetochor nimmt an mehreren Prozessen während der Mitose teil, einschließlich der Aufrechterhaltung der ordnungsgemäßen Befestigung des Chromosoms zur Spindel und der Vermittlung von Kräften zur Bewegung der Chromosomen. Diese Funktionen sind streng abhängig von der Struktur des Kinetochors und seiner Remodellierung durch den Zellzyklus hindurch.Die Molekulare Zusammensetzung des S. cerevisiae Kinetochors wurde bereits präzise beschrieben. Andererseits muss die strukturelle Organisation im zellulären Kontext und andere Kinetochorbestandteile weiter untersucht werden. Die meisten Informationen bezüglich der intakten Kinetochorstruktur kommen aus elektronenmikroskopischen (EM) Untersuchungen und der Fluoreszenzmikroskopie. Aufgrund der geringen Größe des Kinetochors von S. cerevisiae konnte dessen allgemeine Architektur erst kürzlich mittels EM in situ visualisiertwerden. Allerdings fehlt es der Studie an strukturellen Details und die Identität der meisten Kinetochorkomponente wurde nicht festgestellt. Auf der anderen Seite hat die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie einige Informationen über die Lokalisierung einiger Kinetochorkomponenten entlang der Spindelachse bereitgestellt. Dennoch gibt es noch ein paar Engpässe in diesem Ansatz. Aufgrund der Lichtbeugung ist die Auflösung der herkömmlichen Lichtmikroskopie auf 250nm beschränkt. Deshalb ist dieser Ansatz für die Detektion der exakten Verteilung der Kinetochorkomponente innerhalb desselben zu beschränkt. Weiterhin sind einzelne Kinetochore in Hefe nicht sichtbar, da das Fluoreszenzsignal des Clusters gelabelter Hefekinetochore als ein einzelner Fleck wahrgenommen wird. Zusätzlich können feinstrukturelle Details mittels Lichtmikroskopie nicht beobachtet warden. Die hauptsächliche technische Strategie, die genannten Schwierigkeiten zu überkommen ist die Lokalisationsmikroskopie. Diese Technik verbindet mehrere Vorteile von Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie - Lokalisierung mit hoher Präzision (bis auf ca. zehn Nanometer) und die Möglichkeit, strukturelle Einsichten zu einem einzelnen beobachteten Molekülen in seiner natürlichen Umgebung zu gewinnen. Die Gewinnung von Bildern über die Brechungsgrenze hinaus beruht auf der gleichzeitigen Aktivierung nur eines kleinen Bruchteils der Fluorophoren in der Probe. Somit kann ein nicht überlappendes Signal jedes Fluorophors mit beispielloser Präzision lokalisiert werden. Wiederholende Zyklen von Aktivierung, Lokalisierung und Inaktivierung erlauben die Rekonstruktion eines hochaufgelösten Bildes. Das Hauptziel der vorliegenden Studie war es, einen Teil der S. cerevisiae Kinetochorproteine zu lokalisieruen und deren Kopienzahl mittels Lokalisationsmikroskopie zu bestimmen. Anschließend habe ich Zweifarben-Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie verwendet, um die sich widersprechenden Daten zur Lokalisation der Mehrheit der Kinetochorkomponenten in der Metaphase aus Rekonstitutions- und Fluoreszenzmikroskopie-basierten Ansätzen miteinander in Einklang zu bringen. Ich habe den Zählreferenz-Assay etabliert, der es möglich macht, die Proteinkopienzahl eines Proteins von Interesse in S. cerevisiae abzuschätzen. Schließlich habe ich diese Methode verwendet, um die absolute Proteinkopienzahl der wichtigsten Kinetochoruntereinheiten in Metaphase und teilweise in Anaphase zu berechnen. Die Einfarben-Bildgebung rekapitulierte die Rabl-like Verteilung der Kinetochore in der Interphase. Die Metaphasenkinetochore waren zufällig innerhalb des Clusters verteilt. In der Anaphase habe ich eine signifikante Reduktion der Abstände zwischen Kinetochoren beobachtet. Mittels Zweifarben-Bildgebung habe ich Cnn1 und Mif1 über 20nm vom C-Terminus von Spc105 lokalisiert. Die COMA-Komponenten Ctf19 und Okp1 konnten zwischen der centromerischen Position (definiert durch Cnn1 und Mif1) und dem äußeren Kinetochor lokalisiert werden, ca. 14,5 nm von Spc105 entfernt. Die vorherige mikroskopiebasierte Studie hat die C-Termini von MTW1 ca. 9 nm voneinander entfernt positioniert, was den Ergebnissen widerspricht, die durch Kristallisation des Komplexes gewonnen wurden, wobei die C-Termini nur wenige Nanometer voneinander entfernt waren. Mein Ansatz hat hat gezeigt, dass die C-Termini nur 3 nm voneinander entfernt sind. Weiterhin habe ich die C-Termini von Spc105, MTW1 und Spc25 nah aneinander lokalisiert, was mit den Rekonstitutionsdaten übereinstimmt. Weiterhin habe ich gezeigt, dass der C-Terminus von Ndc80 ca 13,5 nm vom C-Terminus von Spc25 entfernt ist, was auf eine leichte Neigung von NDC80 relativ zur Spindelachse hinweist. Ich habe gezeigt, dass der Kernporenkomplex eine verlässliche Zählreferenz zur Schätzung der Kopienzahl der Kinetochorproteine ist. Meine Messungen deuten auf eine graduelle Zunahme der Proteinmenge innerhalb der Kinetochors von Innen nach Außen hin. Ich habe berechnet, dass es 2 Kopien von Mif2 und Cnn1, aber 5 von COMA gibt. Im äußeren Kinetochor gibt es 5-6 Kopien von Spc105, 6-8 von MTW1 und 10-12 von NDC80. Dies steht im Kontrast zur rekonstitutionsbasierten Sicht auf die Kinetochorproteinanzahl. Ich habe nur ein paar der Anaphasenproteine analysiert. Meine Untersuchungen deuten darauf hin, dass MTW1 und NDC80 ihre Kopienzahl erhöhen, was möglicherweise zur Effizienz des Komplexes beim Choromosomentransport am Ende des Zellzyklus beiträgt. In meiner Arbeit habe ich Daten zur Lokalisation der wichtigsten Kinetochorkomponenten während der Metaphase gewonnen. Mithilfe der Zählreferenz konnte ich zeigen, dass das Hefecentromer effizient an den Mikrotubulus bindet, indem es die zunehmende Proteinkopienzahl des Kinetochors nutzt - von 2 Kopien der Centromerzugehörigen Proteine bis zu ca. 10 Kopien der mikrotubulusbindenden Proteine. Ferner habe ich eine Zunahme der Proteinanzahl des äußeren Kinetochors in der Anaphase gefunden.