Label-free and site-specic detection of protein recognition by supramolecular ligands in solution using ultraviolet resonance Raman spectroscopy
In this thesis, ultraviolet resonance Raman (UVRR) spectroscopy was
successfully applied for label-free monitoring of molecular recognition of two proteins dermcidin and leucine zipper by multivalent supramolecular ligands. The ligand molecules contain guanidinium carbonyl pyrrole (GCP), a binding pocket which can be selectively enhanced by UV excitation wavelength. Therefore, the binding between two large systems can be monitored by probing this motif. Preliminary pH and concentration-dependent UVRR experiments were performed in order to nd the optimum pH and concentration of ligand, respectively. We performed the main binding studies with a constant ligand concentration to keep the UVRR spectrum of chromophore as a signature for evaluating the spectral changes upon protein addition. In addition to GCP-based supramolecular ligands and with the purpose of extending the UVRR binding studies to a dierent class of supramolecular ligands, we performed UVRR experiments to evaluate the binding between molecular tweezers and a tripeptide containing lysine moiety. The initial results are promising for future binding studies with molecular tweezers. Two multivariate data analysis methods, NMF and MCR-ALS, were applied for analyzing the pH dependent and UVRR binding studies, with the main advantages of using the whole available spectral information and without any a priori information of the system. The two methods were used for the analysis of the binding study with a three armed GCP ligand
and the protein leucine zipper in order to determine the concentration
proles and the spectral contributions from both free and complexed
ligand. Data analysis with MCR/ALS was performed with the assumption of multisteps equilibria and the qualitative analysis of the calculated concentration proles resulted in the specication of an average binding constant and also two stepwise binding constants using a dened sigmoid function and multi-steps equilibria equations, respectively.
In dieser Doktorarbeit wurde die UV-Resonanz-Raman
(UVRR)-Spektroskopie als markierungsfreie Technik für die Verfolgung der Bindung von supramolekularen multivalenten Liganden mit zwei verschiedenen Proteinen, Dermcidin und Leucin-Zipper, erfolgreich eingesetzt. Die verwendeten multivalenten Ligandenmoleküle besitzen eine Guanidiniocarbonylpyrrol-basierte Bindetasche, deren Raman-Siganlselektiv mit UV-Anregung verstärkt werden kann. Folglich kann die Bindung zwischen supramolekularem Ligand und Protein mittels UVRR-Spektroskopie über die selektive Erfassung des GCP-Motivs verfolgt werden. Vorlauge pH- und Konzentrations-abhängige UVRR-Experimente wurden durchgeführt, um den optimalen pH-Bereich und die optimale Ligandenkonzentration zu ermitteln. Die UVRR-Bindungsstudien wurden mit konstanter Ligandenkonzentration durchgeführt, damit das UVRR-Spektrum des Chromophors als eine Signatur für die Auswertung der spektralen Veränderungen nach Zugabe
des Proteins verwendet werden kann. Zusätzlich zu den GCP-basierten supramolekularen Liganden und der Absicht, die UVRR-Bindungsstudien für andere Klassen an supramolekularen Liganden zu erweitern, wurden auch UVRR-Experimente mit molekularen Pinzetten und einem Tripeptid mit einer Lysin-Einheit durchgeführt. Die ersten Resultate sind vielversprechend für weiterführende Bindungsstudien an molekularen Pinzetten.
Zwei multivariate Verfahren, NMF und MCR-ALS, wurden zur Analyse
der pH-abhängigen UVRR-Experimente und UVRR-Bindungsstudien
verwendet. Die oben genannten Methoden erlauben es, die komplette
verfügbare spektrale Information zu verwenden ohne a priori Wissen über das zugrundeliegende System. Beide Verfahren wurden in den Bindungsstudien eines drei-armigen GCP-basierten Liganden mit dem Protein Leucin-Zipper für die Bestimmung des Konzentrationsprols und der Reinspektren der beiden Komponenten ("freie" versus "komplexierte" GCP-Einheit) eingesetzt. Die Datenanalyse wurde unter Annahme eines mehrstugen Gleichgewichts durchgeführt. Eine qualitative Analyse der berechneten Konzentrationsprole erlaubt die Bestimmung einer
mittleren Bindungskonstante mittels einer denierten Sigmoidfunktion
und zweier stufenweiser Bindungskonstanten mit Hilfe mehrschrittiger
Gleichgewichtsgleichungen.
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