Aktivierung und Inhibition der humanen Serinprotease HTRA1 durch peptidische Modulatoren
Die humane Serinprotease HTRA1 spielt eine wichtige Rolle im Abbau intra- und extrazellulärer Substrate. Durch ihre vielfältigen Funktionen wird sowohl ihre Überexpression als auch eine Herabregulation oder Fehlfunktion mit verschiedenen Krankheitsbildern assoziiert. Dazu zählen Arthritis und die altersbedingte Makuladegeneration bzw. Krebs, Alzheimer und CARASIL. Eine gezielte Aktivierung oder Inhibition der HTRA-Protease wäre daher sowohl für Forschungszwecke als auch spätere therapeutische Maßnahmen erstrebenswert. Wie alle HtrA-Proteasen kann HTRA1 im Gegensatz zu klassischen Serinproteasen reversibel zwischen einer aktiven und inaktiven Konformation wechseln, liegt als Trimer vor und hat eine Cterminale PDZ-Domäne. Bisher wurde für HTRA1 hauptsächlich ein sogenannter induced fit-Aktivierungsprozess durch Substratbindung unabhängig von der PDZDomäne beschrieben.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass HTRA1 zusätzlich einer allosterischen Regulation durch Peptide, die an die PDZ-Domäne binden, unterliegt. Liganden, die initial von C-Termini der humanen Proteine Komplementfaktor D, Cyclin H und Calpain 2 abgeleitet und aufgrund bioinformatischer Analysen modifiziert wurden, wurden auf ihr Aktivierungspotential und Bindungsverhalten getestet. Es konnten Kandidaten mit Affinitäten im niedrigen bis mittleren µM-Bereich identifiziert werden, die HTRA1 im Abbau des nativen Substrats Tau bis zu 10x aktivieren konnten. Den besten allosterischen Aktivator stellt hier EWTDDDLELEA dar. Die allosterische Aktivierung verändert dabei das Substratspektrum von HTRA1. Es konnte zudem gezeigt werden, dass spezifische Reste des Loops L3 essentiell für die HTRA1- Aktivität (R302, Y316) bzw. wichtig für die allosterische Regulation (N311, E306, K305 und D313) sind.
Zusätzlich konnten drei Peptide identifiziert werden, die PDZ-unabhängig eine Aktivierung von HTRA1 herbeiführen können. Diese active site-Aktivierung scheint im Gegensatz zur allosterischen Aktivierung unabhängig von den hier untersuchten Resten des Loops L3 zu erfolgen.
Die Wichtigkeit der PDZ-Domäne für die HTRA1-Aktivität und -Substratspezifität konnte sowohl durch Aufdeckung des allosterischen Mechanismus als auch Entdeckung eines neuen in vitro-Substrates, die Ras-Binde-Domäne von C-RAF, die ohne zusätzliche Aktivatoren nur in Anwesenheit der PDZ-Domäne abgebaut werden kann, herausgestellt werden. In Kooperation mit Steffen Köcher konnte zusätzlich eine neue Substanzklasse, die Ahp-Cyclodepsipeptide (Ahp-CDP), als Grundgerüst für potente nicht-kovalente HTRA-Proteaseinhibitoren identifiziert werden. Dabei wurden durch gezielte Derivatisierungen Hinweise auf einen klassischen Bindemodus erhalten, der im Gegensatz zu vorherigen small molecule-Inhibitoren auch die S‘-Taschen anspricht. Neben einem Grundaufbau aus hauptsächlich kleinen hydrophoben Aminosäuren (Ala, Val, Leu) konnte insbesondere der Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren (Cyclopropylglyin an Position P1 und 4-Chloro-Phenylalanin an P2‘) als Inhibitionsund spezifitätsfördernd für HTRA1 gegenüber Elastase identifiziert werden. Das resultierende Derivat Ahp26 stellt den bisher potentesten HTRA1-Inhibitor mit einem IC50 von 187 nM dar.
Weiterhin konnte die Komplexbildung zwischen HTRA1 und dem natürlich vorkommenden rekombinant gereinigten Serinproteaseinhibitor α1-Antitrypsin (AAT) bestätigt werden und eine erste Optimierung durch die M358V-Mutation an P1 im reactive center loop (RCL) erreicht werden.
Die hier gewonnenen Daten können in einem chemisch-basierten Konzept (Ahp-CDP) sowie in einem biologischen Konzept auf Basis von AAT kombiniert werden, um potentere und spezifischere HTRA1-Inhibitoren zu generieren. Dabei sollten diese neben weiteren Optimierungen der P- und P‘-Reste zusätzlich mit einem allosterischen Liganden kombiniert werden, um zwei Bindestellen von HTRA1 anzusprechen. Sowohl der Ansatz der allosterischen HTRA1-Aktivierung als auch der nichtkovalenten HTRA1-Inhibition bilden wertvolle Grundlagen für die zellbasierte Analyse der Rolle von fehlreguliertem HTRA1 in verschiedenen Krankheitsbildern, da sie die Möglichkeiten offenbaren die HTRA1-Aktivität gezielt und akut zu verändern.
HTRA1, a human serine protease, is an important factor in degradation of intra- and extracellular substrates. Due to its various functions HTRA1 upregulation as well as downregulation or malfunction is implicated in a variety of diseases such as arthritis, age-related macula degeneration or cancer, Alzheimer’s disease and CARASIL. That is why targeted activation or inhibition of HTRA1 can be beneficial for research purposes as well as therapeutic measurements. In contrast to classic serine proteases like trypsin HtrA proteases display reversible activity regulation and oligomeric structures as important features. A so-called induced fit activation due to substrate binding without involvement of the C terminal PDZ domain was described for HTRA1. In this work it is shown that HTRA1 activity is additionally regulated in an allosteric manner via peptides binding to the PDZ domain. Ligands derived from C terminal sequences of the human proteins complement factor D, cyclin H and calpain 2 as well as upon bioinformatical analysis modified variants were analyzed in terms of their binding capability to the HTRA1 PDZ domain. Candidates activating HTRA1 up to 10- fold in degradation of native substrate tau were identified and displayed low to mid µM affinities to the HTRA1 PDZ domain. The best candidate for an allosteric activator was EWTDDDLELEA. Moreover allosteric activation seemed to change the substrate spectrum of HTRA1. Additionally, it was shown that specific residues of loop L3 are essential for HTRA1 activity (R302, Y316) or important for allosteric regulation (N311, E306, K305, D313). Furthermore three peptides that serve as PDZ independent active site activators for HTRA1 were identified. The underlying activation process seemed to work independently of the here investigated loop L3 residues.
A novel in vitro substrate of HTRA1 was identified: the RAS binding domain of C-RAF, whose degradation (without additional activating factors) is exclusively dependent on HTRA1 variants containing the PDZ domain. Based on this and the discovery of the novel allosteric activation an important role for the HTRA1 PDZ domain in substrate specificity and degradation can be postulated.
In collaboration with Steffen Köcher a new substance class, Ahp cyclodepsipeptides (Ahp-CDPs), was identified as scaffold for developing potent non-covalent HTRA inhibitors. Targeted derivatization hinted at a classical binding mode which addresses in contrast to previous small molecule inhibitors also the prime sites (S’) of the substrate binding pocket. With the general inhibitor scaffold consisting of mainly small hydrophobic amino acids (Ala, Val, Leu) the incorporation of non-natural amino acids (cyclopropylglycine at P1 and 4-chloro-phenylalanine at P2’) was identified to promote both HTRA1 inhibition and specificity towards elastase. The resulting compound Ahp26 is so far the most efficient HTRA1 inhibitor (displaying an IC50 of 187 nM). In addition complex formation of HTRA1 with recombinantly purified serine protease inhibitor α1-antitrypsin (AAT) was verified and an initial optimization for the binding ability was achieved by substituting P1-methionine in the reactive center loop (RCL) to valine (M358V).
In order to improve affinity and specificity of HTRA1 inhibitors the results presented in the work at hand can be combined in a chemical approach (Ahp-CDPs) as well as a biological approach based on AAT. For these purposes further optimization of P and P’ residues in Ahp-CDPs and the RCL of AAT should be carried out and the two inhibitor groups should be combined with an allosteric PDZ ligand on a flexible linker in order to address two binding sites in HTRA1.
Allosteric HTRA1 activators as well as non-covalent HTRA1 inhibitors provide important tools for further analyzing the role of HTRA1 in diseases as they allow acutely modifying HTRA1 activity.