Investigation of monoclonal antibodies generated against the growth hormone receptor on growth hormone signaling
The development of monoclonal antibodies (mAbs) targeting the GHR aimed
at lowering the expression of IGF-1 was the main focus of this dissertation. The significance of the project is based on the fact that IGF-1 is associated with a variety of age-related diseases. Hence, the development and characterization of mAbs targeting the GH-IGF-1 axis with the potential to downregulate IGF-1 expression could result in the prevention of such age-related diseases and the augmentation of therapeutic outcomes of age-related diseases.
The initial part of the project constituted the production of five selected
hybridoma clones, which produce five individual α-GHR mAbs targeting different structures of the GHR. Three out of five clones were successfully produced and were the subject of further testing: α-GHR562, α-GHR565, and α-GHR592. In vitro experiments aimed at assessing binding specificity and affinity, the ability to downregulate STAT5 and ERK1/2 phosphorylation, as well as IGF-1 luciferase promoter reporter activity, showed variable characteristics of the tested mAbs. Binding affinity for candidates α-GHR562 and α-GHR592 could be determined, but no binding of α-GHR565 could be detected. Furthermore, all three mAbs significantly downregulated STAT5 phosphorylation, a marker tested for any immediate effects of mAbs on GH signaling. However, none of the tested mAbs induced any significant changes in the phosphorylation of ERK1/2 and the IGF-1 luciferase promoter reporter activity tests. Testing of the mAbs in vivo revealed no significant effect of α-GHR562 or α-GHR565 on circulating IGF-1 levels. On the other hand, significant increases in serum ALT (alanine transaminase) levels was observed after α-GHR592 treatment, indicative of induced liver toxicity. Additionally, an increase in the general immune response marker SAP (serum amyloid protein) was detected, however this increase was not significant. Interpretation of the compiled data set might indicate that, out of the tested mAbs, α-GHR592 might be the most promising candidate thus far in establishing a drug to manipulate GH signaling
Der Schwerpunkt der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung von
monoklonalen Antikörpern (moAks), die spezifisch den Somatotropin-Rezeptor
(GHR) binden und somit theoretisch die Expression des insulinähnlichen
Wachstumsfaktors IGF-1 herunterregulieren. Dies ist von besonderem Interesse, da erhöhte Konzentrationen von IGF-1 im Serum mit einer Vielzahl von altersbedingten Erkrankungen assoziiert ist. Aufgrund dessen könnte die Entwicklung von moAks die spezifisch den Somatotropin-Rezeptor binden und somit potentiell die Expression von IGF-1 herunterregulieren, zu einer Effektivitätssteigerung von Behandlungen und zur Prävention von altersbedingten Erkrankungen beitragen.
Der erste Teil des Projektes bestand in der Aszites Produktion von fünf individuellen α-GHR moAks, die unterschiedliche Strukturen des GHR binden. Die Produktion gelang in drei von fünf Fällen, und entsprechende moAks waren der Gegenstand weiterer Anwendungen: α-GHR562, α-GHR565, und α-GHR592. Eine Vielzahl von in vitro Experimenten wurden zwecks Charakterisierung der moAks ausgeführt. Diese Experimente beinhalteten unter anderem eine Charakterisierung bezüglich der Bindungsaffinität, bezüglich der Fähigkeit zur Herunterregulierung der Phosphorylierung von STAT5 und ERK1/2, sowie Teste bezüglich der IGF-1 Luciferase-Promoter-Reporteraktivität. Die Bindungsaffinität für die Kandidaten α-GHR562 und α-GHR592 konnten ermittelt werden, jedoch konnten keine bedeutenden Parameter für α-GHR565 erhalten werden. Darüber hinaus wurde die Phosphorylierung von STAT5 von allen drei moAks signifikant erunterreguliert.
STAT5 stellt dabei einen Marker dar, der im Rahmen von unmittelbaren Effekten von moAks auf die Signalgebung durch den GHR getestet wird. Jedoch konnten keine signifikanten Änderungen in der Phosphorylierung von ERK1/2 und in den IGF-1 Luciferase-Promotor-Reporteraktivitätstests nachgewiesen werden. Das Testen der moAks α-GHR562 und α-GHR565 in vivo zeigte keine signifikanten Änderungen von IGF-1 Konzentrationen im Serum. Andererseits konnten zytotoxische Wirkungen von α-GHR592 nachgewiesen werden. Ein signifikanter Anstieg von ALT (Alanin-Aminotransferase), welcher einen induzierten Leberschaden andeutet, und ein Anstieg von SAP (Serum-Amyloid-Protein) Werten im Serum deutet Zytotoxizität an.
Die Interpretation der Datensätze könnte somit darauf hinweisen, dass α-GHR592 den vielversprechendsten Kandidaten für die Etablierung eines moAks zur Beeinflussung der GH-Signalübertragung darstellt