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Biofunctionalisation of calcium phosphate nanoparticles for applications in molecular biology and biomedicine

Kopp, Mathis

This work comprises the syntheses and characterisations of different formulated calcium phosphate nanoparticles for various biomedical and molecular biology applications, including immunisation, vaccination, transfection and cell-targeting. It investigates the transport and the functionalisation of a broad set of biomedically and molecular biology relevant molecules and gives an overview over the feasible applications for the usage of calcium phosphate nanoparticles. This work has successfully shown the cloning of bimodal expression systems for the investigation of translation and transcription. The resulting plasmids could be used for the nanoparticular transfection. Moreover, the successful cloning and production of a new promising class of aptamers (chimeric aptamers) was shown, as well as their conjugation on the surface of calcium phosphate nanoparticles. Different biomolecules, including targeting sequences (iRGD, antibodies, anti-cancer drugs, or antigens) could be covalently attached on the surface of thiol-terminated and silica-coated calcium phosphate nanoparticles using a various set of cross coupling chemicals. These nanoparticles were also successfully used as a carrier for different immunogenic adjuvants (rSF, poly(I:C), CpGm) to improve the immune response of nanoparticle-presented antigens to the host immune system. The usage of triple shell calcium phosphate nanoparticles allowed the endocytosis-mediated transport of various molecular biology relevant molecules, such as phycoerythrin (R-PE), tandem plasmids or proteins across the cell membrane. It was not possible though to transport the in vitro transcribed polyA+-tandem-mRNA with the help of calcium phosphate nanoparticles. Triple shell calcium phosphate nanoparticles were also successfully used as transfection agents for the plasmid pCherries’n’Broccolies, using the fluorescent protein mCherry and the RNA imaging aptamer dBroccoli as probes to analyse transcriptional or translational cellular processes. The transport of the auto fluorescent protein reveals the fate of a nanoparticle-transported protein. These results were later confirmed, especially by the uptake analysis of the tandem protein. It turned out that the successful nanoparticle-transport is dependent on the biomolecule (DNA, RNA, protein) that is used. Calcium phosphate nanoparticles have demonstrated an extraordinary wide field for applications. Thus, the successful covalent attachment of HSV-1 glycoprotein B derived antigens to the nanoparticles, leading to a prophylactic protection against HSV infections, which was demonstrated by the high survival rate of treated mice. Although some of the projects could not finally be accomplished, but some interesting indications were found and will be helpful for future projects. However, the usage of calcium phosphate nanoparticles was demonstrated as an effective and valuable carrier or presenting system that will give rise to versatile useful biomedical and molecular biology relevant nanotools in the future.

Diese Arbeit thematisiert die Synthesen und Charakterisierungen von Calciumphosphat-Nanopartikeln für biomedizinische und molekularbiologische Anwendungen, wie die Immunisierung, Vakzinierung, Transfektion oder spezifische Zellmarkierung. Die Arbeit untersucht den Transport sowie die Funktionalisierungsmöglichkeiten eines breiten Spektrums an biomedizinisch und molekularbiologisch relevanten Molekülen und gibt einen Überblick über mögliche Anwendungen für den Gebrauch von Calciumphosphat Nanopartikeln. Diese Arbeit konnte erfolgreich die Generierung eines bimodalen Expressionssystems zeigen, welches zur Untersuchung von Transkription und Translation angewendet werden könnte. Die resultierenden Plasmide ließen sich zur nanopartikel-basierten Transfektion nutzen. Darüber hinaus, konnte die erfolgreiche Klonierung und Produktion einer neuen Aptamerklasse (chimäre Aptamere) erfolgreich gezeigt werden und ebenfalls deren Konjugation auf der Oberfläche von Calciumphosphat Nanopartikeln. Verschiedene Biomoleküle mit zielgerichteter und epitoperkennende Funktion wie dem cyclischen Nonapeptid iRGD sowie Antikörper (CD146, IgG1, IgG2, F4/80), immunogene Antigene (P1 und P2) oder Zytostatika (Doxorubicin) konnten unter Verwendung verschiedener heterobifunktioneller Crosslinker kovalent auf der Oberfläche von thiol-terminierten und silica-umhüllten Calciumphosphat Nanopartikeln angebracht werden. Diese Nanopartikel wurden ebenfalls erfolgreich als Trägersystem für unterschiedlicher immunogene Adjuvanzien (rSF, poly(I:C), CpGm) verwendet, um die Immunantwort auf die nanopartikel-präsentierten Antigene des Zielorganismus zu verbessern. Die Verwendung von dreischaligen Calciumphosphat-Nanopartikeln erlaubte den endozytose-vermittelten Transport von verschiedenen molekularbiologisch relevanten Molekülen in die Zelle über die Zellmembran, wie zum Beispiel dem Phycoerythrin (R-PE), dem Plasmid zur eukaryotischen Tandemexpression (mRFP GFP) oder dem Tandemprotein. Es war nicht möglich, die in vitro transkribierte polyA+-tandem-mRNA mithilfe von dreischaligen Calciumphosphat-Nanopartikeln in Zellen zu transportieren. Dennoch wurden dreischalige Calciumphosphat-Nanopartikel erfolgreich als Transfektionsagens für das Plasmid pCherries’n’Broccolies verwendet, welches über das fluoreszente Protein mCherry und dem DFHBI-fluoreszenzinduzierbaren RNA-Aptamer dBroccoli als Sonden zur Analyse von transkriptionellen und/oder translationalen zellulären Prozessen nutzen. Der Transport eines auto-fluoreszenten Proteins in die Zelle wie beispielsweise dem R-PE kann Aufschluss über das Schicksal eines über nanopartikel-transportieren Proteins geben. Die dabei resultierenden Ergebnisse konnten insbesondere durch die Aufnahmestudie des Tandemproteins bestätigt werden. Hierbei zeigte sich, dass der erfolgreiche nanopartikel-basierte Transport von der Art des zu transportierenden Biomoleküls (DNA, RNA, Protein) abhängig ist. Calciumphosphat-Nanopartikel konnten ein äußerst weites Anwendungsspektrum demonstrieren. So auch bei der kovalenten Anbringung von HSV-1 Glykoprotein B abgeleiteten Antigenen auf die Nanopartikeloberfläche, welche nach Immunisierung letztlich zu einem prophylaktischen Schutz gegen HSV-1 Infektionen in Mäusen führte und durch die hohe Überlebensrate der mit Nanopartikeln behandelten Mäuse demonstriert wurde. Trotz der Tatsache, dass Projekte nicht zu Abschluss gebracht werden konnten, so wurden doch interessante Hinweise gefunden die hilfreich für zukünftige Arbeiten sein werden. Die Verwendung von Calciumphosphat-Nanopartikel demonstrierte sich hierbei als ein effektives und wertvolles Träger- oder Präsentationsystem, welches sicherlich auch in Zukunft die Entwicklung einer Vielzahl an verschieden nützlichen biomedizinisch und molekularbiologisch relevanten Nanowerkzeugen ermöglichen wird.

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Kopp, Mathis: Biofunctionalisation of calcium phosphate nanoparticles for applications in molecular biology and biomedicine. 2018.

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