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Cell cycle-dependent gene expression by Mybl2 - a tumor suppressor in MDS

Severmann, Julia

MYBL2 has been identified as a dosage-dependent tumor suppressor in myelodysplastic syndromes (MDS). The gene is ubiquitously expressed and encodes a transcription factor which is strictly required for cell cycle progression. Of note, downregulation of Mybl2 expression levels to 30 - 50 % (sub-haploinsufficiency) provides a clonal advantage to hematopoietic stem and progenitor cells in vivo. Yet, the molecular mechanism of this phenotype is unknown. In this thesis, I aimed to identify Mybl2 candidate target genes responsible for its tumor suppressor function by analyzing Mybl2-dependent gene expression differences at the cell cycle phase level in murine hematopoietic stem and progenitor cells. Here I show that RNA interference-mediated knockdown of Mybl2 to sub-haploinsufficient levels allows freshly isolated hematopoietic stem and progenitor cells to proliferate and expand in vitro. The re-expression of wild type Mybl2 abrogated the growth of these cells within a few days. Unfortunately, the reversion of the growth phenotype could not be reproduced consistently. As a consequence, for gene expression analysis I used an inducible Mybl2 knockdown approach in murine hematopoietic stem and progenitor cells that were immortalized with dominant-negative RUNX1. Additionally, I established the expression of a cell cycle phase-dependent indicator protein (Venus-GMNN(1/110)) that allowed the undisturbed separation of cells at the different cell cycle phases by flow cytometry. I exploited the combination of the inducible Mylb2 knockdown and the Venus-GMNN(1/110)-based cell cycle phase separation to identify candidate target genes affected by reduced levels of Mybl2. The well-established Mybl2 target genes, Cyclin B1 (Ccnb1) and Foxm1, showed a significantly reduced expression upon Mybl2 downregulation even without cell cycle phase-resolution. In addition, my results demonstrated that the expression levels of Aspm and Nusap1, two genes important for spindle formation during mitosis, were influenced by Mybl2. I could also show that the expression levels of Cyclin E (Ccne1) and Dhfr, two classical cell cycle regulatory genes, were reduced upon low expression levels of Mybl2. Comparing the cells with reduced Mybl2 expression level and controls sorted for the different cell cycle phases the strongest expression differences were determined comparing the G1 phases. My data confirmed Cyclin B1 and Foxm1 as Mybl2 target genes and newly identified Aspm, Nusap1, Dhfr and Cyclin E as regulated upon Mybl2 gene-dosage changes. These findings point towards a role of these genes in a cell cycle-related tumor suppressor function of Mybl2 and, for instance the regulation of Aspm, towards a possible role of Mybl2 in cell fate decision.

MYBL2 ist ein dosis-abhängiger Tumorsuppressor in Myelodysplastischen Syndromen. Dieses Gen ist ubiquitär exprimiert und kodiert einen Transkriptionsfaktor, der unabdingbar für den Ablauf des Zellzyklus ist. Die Verminderung der Mybl2 Expression auf 30 - 50 % des Normallevels führt jedoch zu einem klonalen Expansionsvorteil hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen in vivo. Die Komponenten des molekularen Mechanismus dieses Phänotyps sind bisher völlig unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es Kandidatengene, die maßgeblich an der Tumorsuppressorfunktion von Mybl2 beteiligt sind, mittels zellzyklusaufgelöster Genexpressionsanalysen zu identifizieren. Zunächst konnte ich zeigen, dass frisch isolierte murine hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen durch einen RNA-Interferenz-vermittelten Knockdown von Mybl2 auf 30 - 50 % auch in vitro einen Expansionsvorteil haben. Die ektopische Expression von Wildtyp Mybl2 konnte diesen Expansionsvorteil in kurzer Zeit aufheben. Leider ließ sich dieses Ergebnis nicht konstant reproduzieren. Für die geplanten Genexpressionsanalysen nutzte ich daher die Induzierbarkeit eines RNA-Interferenz vermittelten Mybl2 Knockdowns in murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen, die mittels dominant-negativem RUNX1 immortalisiert wurden. Zusätzlich habe ich die Expression eines zellzyklusregulierten Indikatorproteins (Venus-GMNN(1/110)) in hämatopoetischen Zellen etabliert, welche die durchflusszytometrische Trennung von Zellpopulationen entsprechend der einzelnen Zellzyklusphasen erlaubt. Die Kombination dieser beiden Systeme habe ich genutzt, um mittels Genexpressionsanalysen Targetgene von Mybl2 zu identifizieren, die durch Verminderung des Mybl2 Expressionslevels unterschiedlich reguliert werden. Die bereits etablierten Mybl2 Targetgene, Cyclin B1 (Ccnb1) und Foxm1, zeigten schon ohne Beachtung der Zellzyklusauflösung ein deutlich herabgesetztes Expressionslevel. Weiterhin war die Expression von Aspm und Nusap1, zwei Gene, die wichtig für die Formation der Mitosespindel sind, ebenfalls stark von reduzierten Mybl2 Expressionsleveln betroffen. Auch die Expression von Cyclin E und Dhfr, zwei klassischen Regulatoren des Zellzyklus, war in Zellen mit Verminderung des Mybl2 Expressionslevels deutlich erniedrigt. Die Genexpression im Vergleich der einzelnen Zellzyklusphasen zeigte, dass insbesondere die Expression in der G1 Phase bei allen Mybl2 Targetgenen vermindert ist. Meine Arbeit bestätigte Cyclin B und Foxm1 als Mybl2 Targetgene, zeigte aber auch, dass die Expression von Aspm, Nusap1, Dhfr und Cyclin E stark von Mybl2 Gendosisveränderungen betroffen war. Dies lässt zum einen eine Funktion dieser Gene in einer zellzyklusnahen Tumorsuppressorfunktion von Mybl2 vermuten, andererseits weist die Regulation, zum Beispiel von Aspm, auf eine mögliche Beteiligung von Mybl2 an der Zellschicksalsentscheidung hin.

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Severmann, Julia: Cell cycle-dependent gene expression by Mybl2 - a tumor suppressor in MDS. 2018.

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