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Biofunktionalisierung von Implantat-Modelloberflächen mit Wachstumsfaktoren und Adhäsionsproteinen

Ettelt, Volker

Diese Arbeit befasst sich mit der Biofunktionalisierung von Implantat-Modelloberflächen und deren Charakterisierung. Die Implantat-Modelloberflächen bestanden aus Titanoxid (TiOx) bzw. Calciumphosphat (CaP). Die Biofunktionalisierung basierte auf einem supramolekularen Biotin-Streptavidin-System, auf das verschiedene Biomoleküle adsorbiert wurden. Die Modelloberflächen wurden mit Hochfrequenz-Magnetron-Sputtering hergestellt; die anschließende Biofunktionalisierung beruhte auf Selbstassemblierung. Die Charakterisierung wurde mittels Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie, Ellipsometrie, Wasser-Kontaktwinkelmessungen und Fouriertransformierter Infrarotreflektionsabsorptionsspektroskopie durchgeführt. Der Biofunktionalisierungsansatz für TiOx-Modelloberflächen wurde im Blick auf Stabilität und die Unterdrückung nicht-spezifischer Adsorptionsprozesse getestet. Um das osteoinduktive Potential zu untersuchen, wurde die Biofunktionalisierung um biotinyliertes BMP-2, BMP-2/6 und Fibronektin erweitert. Zur Ermittlung ihres Stimulationspotentials von Weichgewebe wurde biotinyliertes FGF-2 spezifisch immobilisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Streptavidin-Monolage auf TiOx-Modelloberflächen sowohl die nicht-spezifische Adsorption von Plasmaproteinen als auch die Adsorption verschiedener Bakterien unterdrückte. Gleichzeitig war spezifische Bioaktivierung und Stimulierung humaner osteoblastärer Zellen mittels Immobilierung von BMP-2 und BMP-2/6 sowie von mit Fibronektin kombiniertem BMP-2 und BMP-2/6 möglich. Die Immobilisierung von FGF-2 resultierte in einer erhöhten Proliferation von Fibroblasten, während BMP-2 keine Fibroblasten stimulierte. Diese Ergebnisse wurden im Hinblick auf ihre Bedeutung für die Herstellung multifunktionaler Implantate diskutiert. Darüber hinaus wurden CaP-Modelloberflächen auf Möglichkeiten der Übertragung des Streptavidin-Biotin-Biofunktionalisierungsansatzes untersucht. Die Übertragung der Biotin-Streptavidin-Biofunktionalisierung auf CaP in wässrigen Lösungsmitteln schlug fehl, gelang jedoch in einem DMSO-PBS-Gemisch im Verhältnis 30:70 (v/v). Zudem war die Streptavidinadsorption an Biotin in diesem Medium verstärkt. Die Biofunktionalisierung wurde sowohl mit als auch ohne eine stabilisierende Silikaschicht übertragen. Es konnte gezeigt werden, dass die Menge an adsorbiertem Streptavidin unabhängig von der Aufbringung einer Silikaschicht war. Die Bindungseigenschaften der Biofunktionalisierung auf CaP wurden mit XPS analysiert, wodurch die Möglichkeit einer Bindung an die Oberflächen-Hydroxylgruppen von CaP aufgezeigt wurde. In zukünftigen Arbeiten soll die Übertragung dieses Biofunktionalisierungs-ansatzes auf verschiedene Oberflächen getestet werden. Dies könnte zu zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten in klinischen Einsatzgebieten, z. B. in der Herstellung bioinerter Katheteroberflächen, führen. Um den Sicherheitsansprüchen zu genügen, müssen toxikologische und immunologische Parameter in vivo untersucht werden. Des Weiteren kann diese Biofunktionaliserung zur Herstellung von Oberflächen mit räumlich genau angeordneten Biomolekülen genutzt werden. Damit sind oberflächenkonzentrationabhängige Untersuchungen möglich, um herauszufinden, wo die minimale und maximale Stimulationsdosis für die Zellen liegt. So kann der Überdosierung von Biomolekülen mit hohem Stimulationspotential (z. B. Wachstumsfaktoren) vorbeugt werden. Die Biofunktionalisierung ist ein modulares System. Verschiedene Biomoleküle können in Multischichten immobilisiert werden. Dies kann zum schrittweisen Aufbau einer künstlichen extrazellulären Matrix genutzt werden, indem Proteinen mit Stützfunktion, Zytokine und Glykosaminoglykane sequentiell adsorbiert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgestellte Biofunktionalisierung eine Vielzahl zukünftiger Anwendungen sowohl in medizinischen als auch technologischen Bereichen möglich machen kann.

This work comprises the biofunctionalisation of implant model surfaces and the characterisation thereof. The implant model surfaces consisted of TiOx, or CaP, respectively. The biofunctionalisation was based on a supramolecular biotin-streptavidin-system on which several biomolecules were adsorbed. The model surfaces were prepared with rf-magnetron sputtering; the subsequent biofunctionalisation was based on self-assembly processes. Characterisation was performed with surface plasmon resonance spectroscopy, ellipsometry, water contact angle measurements and fourier-transformed infrared reflection absorption spectroscopy. The TiOx model surface biofunctionalisation approach was tested with regard to stability and the suppression of nonspecific adsorption processes. To investigate the osteoinductive potential, the biofunctionalisation was extended by conjugation of biotinylated BMP-2, BMP-2/6, and fibronectin. To test its stimulation potential of soft tissue, biotinylated FGF-2 was conjugated. The streptavidin monolayer on TiOx model surfaces was shown to suppress nonspecific adsorption of plasma proteins as well as adsorption of several bacterial species. Simultaneously, specific bioactivation and stimulation of human osteoblastic cells was possible with immobilisation of BMP-2 and BMP-2/6, as well as BMP-2 and BMP-2/6 both combined with fibronectin. Immobilisation of FGF-2 resulted in an increased proliferation of fibroblasts while BMP-2 did not stimulate fibroblasts. These results were discussed regarding their relevance for the preparation of multifunctional implants. Besides, CaP model surfaces were investigated with respect to transfer possibility of the streptavidin-biotin biofunctionalisation approach. Transfer of the biotin-streptavidin biofunctionalisation onto CaP failed in aqueous media but was successful in a mixture of DMSO and PBS at a ratio of 30:70 (v/v). Additionally, streptavidin adsorption to biotin was significantly enhanced in that mixture. The biofunctionalisation was transferred with and without a stabilising silica layer. The amount of adsorbed streptavidin was shown to be independent of the implementation of a silica layer. The binding properties of the biofunctionalisation to CaP were analysed with XPS measurement, showing the possibility of a conjugation to the surface hydroxyl groups of CaP. For future work, transfer of this biofunctionalisation approach to various surfaces should be tested. This might yield multiple applications in clinical use, e. g. for the creation of bioinert surfaces on catheters. To meet safety aspects, toxicological and immunological impacts have to be tested in vivo. Further, this biofunctionalisation can be used for the preparation of surfaces with spatially ordered biomolecules. This makes a surface-concentration-dependent testing in order to find the minimum and maximum stimulation dose for the cells possible. Prevention of side effects due to overdosage of biomolecules with a high stimulation potency (e. g. growth factors) will be possible. The biofunctionalisation is a modular system. Various biomolecules can be immobilised in multilayers. This can be used to create an artificial extracellular matrix consisting of structural proteins, cytokines and glycosaminoglycans. To sum up, the presented biofunctionalisation offers a multitude of future applications in medicinal as well as technical areas.

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Ettelt, Volker: Biofunktionalisierung von Implantat-Modelloberflächen mit Wachstumsfaktoren und Adhäsionsproteinen. 2018.

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