Kinetochore-driven control of meiotic DNA break formation and recombination at centromere-proximal regions

Kuhl, Lisa-Marie GND

Controlled DNA double-strand break formation followed by homologous crossover recombination is essential to link homologous chromosomes and drive faithful chromosome segregation during meiosis. However, the formation of crossovers in the chromosomal regions surrounding the centromeres, also referred to as pericentromeres, is associated with meiotic chromosome mis-segregation and developmental aneuploidy in diverse eukaryotic organisms. In humans, crossover formation at pericentromeres is associated with the incidence of Trisomy 21 (Down’s syndrome). In this study, we demonstrated that the multi-protein complex that assembles onto centromeres, the kinetochore, actively suppresses meiotic crossover recombination at pericentromeric regions in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Within kinetochore assembly, we identified the conserved Ctf19 complex as the major factor in suppressing crossover formation close to centromeres. We revealed that the Ctf19 complex provides a multi-layered mechanism to exert crossover suppression. One layer of Ctf19 complex mediated crossover suppression is the inhibition of DNA break formation in the direct vicinity of centromeres. In addition to the Ctf19 complex, we showed that the Mtw1 complex, another conserved subunit of the budding yeast kinetochore, inhibits meiotic DNA break formation close to centromeres. However, this inhibition is not absolute as meiotic DNA breaks occur within centromere-proximal regions, although the overall amount is reduced. To channel residual DNA breaks away from a pathway that uses the homologous chromosome as a repair template, the Ctf19 complex provides another layer of suppression. This layer involves the Ctf19 complex promoted establishment of cohesin containing the meiosis-specific Rec8 subunit at centromeres and pericentromeres. The establishment of Rec8-cohesin in turn directs the association of the synaptonemal complex protein Zip1 with centromeric and pericentromeric regions. Both proteins Rec8-cohesin and Zip1 are required to suppress crossover recombination near centromeres. To understand the molecular basis of the Ctf19 complex-driven control of meiotic crossover recombination, we developed a synthetic targeting system, based on CRISPR/ dCas9 technology, that allows us to isolate components of the Ctf19 complex from kinetochores. Using this system, we directed Ctf19 complex proteins to an ectopic site, a non-centromeric region, and revealed sufficiency of a specific protein (called Ctf19) in the local control of crossover recombination. The role of the Ctf19-C in controlling crossover recombination near centromeres might represent a rationale of how the incidence of meiotic chromosome segregation defects and the generation of aneuploid gametes is prevented.

Während der Meiose ist die kontrollierte Bildung von DNA Doppelstrangbrüchen und die darauf folgende homologe Crossover Rekombination essentiell, um homologe Chromosomen zu verbinden und akkurat zu trennen. Die Entstehung von Crossovern in chromosomalen Regionen um die Centromere, auch als Pericentromere bezeichnet, ist allerdings mit Chromosomenfehlverteilung und Aneuploidie in diversen eukaryotischen Organismen verbunden. Bei Menschen ist die Entstehung von Crossovern in Pericentromeren mit Trisomie 21 (Down Syndrom) assoziiert. In dieser Studie demonstrierten wir, dass der Multiproteinkomplex der sich auf Centromeren zusammensetzt, genannt das Kinetochore, Crossover Recombination in pericentromeren Regionen der Hefe Saccharomyces cerevisiae aktiv unterdrückt. Innerhalb des Kinetochores identifizierten wir den konservierten Ctf19 Komplex als einen Hauptfaktor in der Unterdrückung von Crossover Bildung in der Nähe von Centromeren. Wir offenbarten, dass der Ctf19 Komplex einen mehrschichtigen Mechanismus zur Verfügung stellt, um Crossover-Unterdrückung zu gewährleisten. Eine Schicht, der vom Ctf19 Komplex ausgehenden Crossover Unterdrückung, stellt die Inhibierung von DNA Doppelstrangbrüchen in direkter Nachbarschaft von Centromeren dar. Zusätzlich zu dem Ctf19 Komplex zeigten wir, dass der Mtw1 Komplex, eine weitere konservierte Untereinheit des Hefe-Kinetochores, die Bildung von Doppelstrangbrüchen in der Nähe von Centromeren inhibiert. Diese Inhibierung ist allerdings nicht vollständig, obwohl die Gesamtanzahl von DNA Brüchen, die in der Centromere-Region enstehen, reduziert ist. Um verbleibende DNA Brüche von einem Pfad, der homologe Chromosomen als Reparaturvorlage benutzt, abzulenken, stellt der Ctf19 Komplex eine weitere Schicht zur Unterdrückung bereit. Diese Schicht beinhaltet die vom Ctf19 Komplex geförderte Anreicherung von Cohesin mit der meiose-spezifischen Rec8 Untereinheit bei Centromeren und Pericentromeren. Die Anreicherung von Rec8-Cohesin steuert wiederum die Assoziierung des Proteins Zip1 des synaptonemalen Komplexes mit centromerischen und pericentromerischen Regionen. Sowohl Rec8-cohesin als auch Zip1 sind benötigt um Crossover Recombination in der Nähe con Centromeren zu unterdrücken. Um die molekulare Basis des Ctf19 Komplexes in der Kontrolle von Crossover Recombination zu verstehen, entwickelten wir ein synthetisches System, basierend auf CRISPR/ dCas9 Technologie, dass uns ermöglichte Komponenten des Ctf19 Komplexes vom Kinetochore zu isolieren. Durch Anwendung dieses Systems lenkten wir Proteine des Ctf19 Komplexes zu einer ektopischen Stelle, eine nicht-centromere Region, und offenbarten, dass das Protein Ctf19 ausreichend ist um Crossover Recombination zu unterdrücken. Die Funktion des Ctf19 Komplexes in der Unterdrückung von Crossover Recombination in der Nähe von Centromeren könnte ein Grundprinizip darstellen, wie meiotische Chromosomenfehlverteilungen und die Entstehung von aneuploidien Gameten verhindert werden.

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Kuhl, Lisa-Marie: Kinetochore-driven control of meiotic DNA break formation and recombination at centromere-proximal regions. 2019.

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