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Interaktionsanalyse der Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktoren HIF-2α und ARNT unter Berücksichtigung der Einflussnahme durch den HIF-2α-Liganden N-(3-Chloro-5-fluorophenyl)-4-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-5-amine und verschiedener HIF-2α-Mutationen

Pisarenko, Irina

Unter Hypoxie werden die sog. Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktoren (HIFs) in Zellen aktiviert, die im Zellkern an die DNA binden und eine Genexpression auslösen. HIFs sind in verschiedene physiologische (z. B. Embryogenese) und pathophysiologische Prozesse (z. B. das Tumorwachstum und die Metastasierung) involviert (Lisy und Peet 2008). In dieser Arbeit wurden Interaktionen von HIF-Untereinheiten durch Messung des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) in lebenden humanen Osteosarcom-Zellen U2OS untersucht. Dafür wurden die U2OS-Zellen mit fluoreszenzmarkierten Fusionsplasmiden, die für HIF-Untereinheiten codieren, transfiziert. Für eine FRET-Messung wurde eine CFP (cyan fluorescent protein)- und eine YFP (yelow fluorescent protein)-gekoppelte HIF-Untereinheit verwendet. Das primäre Ziel des Promotionsprojekts war die Wirkung der Verbindung N-(3-chloro-5-fluorophenyl)-4-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-5-amine, die als ein selektiver HIF-2α-Antagonist befunden wurde (Scheuermann et al. 2013), auf die HIF-2α / ARNT-Interaktion zu prüfen. In dieser Arbeit konnte keine Inhibierung der Dimerisierung von HIF-2α und ARNT durch FRET-Messungen in lebenden Zellen festgestellt werden. Der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer konnte detektiert werden und war spezifisch für zwei interagierende Proteine. Mit Hilfe der Co-Immunpräzipitations-Analyse, einer Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktion in vitro, wurde eine Reduktion der Komplex-Bildung zwischen HIF-2α und ARNT, jedoch keine komplette Unterbrechung des Komplexes, nach Zugabe des HIF-2α-Antagonisten detektiert. Zusätzlich wurde der Einfluss von verschiedenen Mutationen in der HIF-2α-Untereinheit auf die Dimerisierung mit ARNT untersucht. Nur ein unspezifisches FRET-Signal (Random FRET) wurde bei der Messung der Interaktion von HIF-2α-Untereinheit, die drei Punktmutationen in der PAS-B-Domäne (Gln322Glu, Met338Glu, Tyr342Thr) enthielt, und ARNT detektiert. Ebenfalls führte die Deletion der ganzen PAS-Domäne in der HIF-2α-UE zur Inhibierung der Komplex-Bildung mit ARNT. Dagegen beeinträchtigte eine Punktmutation (Cys138Tyr) in der HIF-2α-PAS-A-Domäne sowie die Deletion von Thr870 die HIF-2α / ARNT-Interaktion nicht. Das spezifische FRET-Signal konnte auch zwischen den Transkriptionsfaktoren HIF-1α und HIF-2α sowie HIF-2α und HIF-2α gemessen werden. Die Co-IP-Ergebnisse lieferten eine Bestätigung der HIF-2α / HIF-2α-Interaktion.

Hypoxia-inducible transcription factor (HIF) complexes regulate expression of genes responsible for cellular adaptation to hypoxia. HIFs are heterodimers and consist of a labile, O2-sensitive α-subunit and a stable β-subunit (also known as aryl hydrocarbon nuclear translocator, ARNT). Both subunits belong to the family of basic helix-loop-helix (bHLH) proteins containing a Per-ARNT-Sim (PAS) domain (Semenza et al. 1997). Under hypoxia, HIF-α subunits translocate from the cytoplasm to the nucleus and form active HIF α / ARNT heterodimers which bind to DNA and induce transcription of hundreds of genes, e. g. transcription of endothelial growth factor (VEGF), erythropoietin, or glucose transporter (Fandrey et al. 2006). The major aim of this research project was to investigate the impact of the compound N-(3-chloro-5-fluorophenyl)-4-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-5-amine, published as the selective HIF-2α antagonist (Scheuermann et al. 2013), on the interaction mode of HIF-2α and ARNT in living cells. Additionally, the effects of mutations or deletions in the HIF-2α subunit on its interaction with ARNT were analyzed. Moreover, the interaction of HIF-1α and HIF-2α was examined, hypothesizing an interplay between these two subunits. To analyze molecular interactions of HIF subunits, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy was applied. For that purpose different plasmid constructs, fused to either enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) or enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) were transfected into human osteosarcoma cells U2OS. The FRET measurements were performed in living U2OS cells under normoxic conditions (21% O2 and 5% CO2). Distinct FRET signals were detected in transfectants containing HIF-1α and ARNT which are known to form active heterodimers (Semenza et al. 1997). Only unspecific FRET characteristic for non-interacting proteins was observed in cells overexpressing the HIF subunits HIF-2α without PAS domain and ARNT, and also HIF-2α PAS B triple-point mutant (Gln322Glu, Met338Glu, Tyr342Thr) and ARNT. Our FRET measurement results could not validate the disruption of HIF-2α / ARNT interaction by the compound N-(3-chloro-5-fluorophenyl)-4-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-5-amine in living cells. A distinct FRET signal, typical for interacting proteins, could be detected. However, the co-immunoprecipitation analysis showed a little reduction of the complex formation of HIF-2α and ARNT after addition of the compound. Nevertheless, both FRET measurements and co-immunoprecipitation analysis validated no disruption of the complex formation. It should be taken into account that the FRET measurement findings resulted from living cells incubated under intact natural conditions. Hypothesizing an interplay between HIF-1α and HIF-2α, FRET was measured in transfectants overexpressing these two proteins and a FRET signal could be detected. Moreover, the expression of HIF-1 target gene CA-IX was significantly reduced after overexpression of HIF-2α. However, the overexpression of the transcriptionally inactive HIF-2α subunit lacking its DNA binding domain bHLH did not impede the mRNA expression of CA-IX. Both co-immunoprecipitation assays applied in this research did not clearly show an interaction between HIF-1α and HIF-2α. In contrast, the interaction of two HIF-2α subunits could be shown by co-immunoprecipitation assays. Fandrey J., Gorr T. A., Gassmann M. (2006): Regulating cellular oxygen sensing by hydroxylation. Cardiovascular Research 71 642–651 Scheuermann T. H., Li Q., Ma H. W., Key J., Zhang L., Chen R., Garcia J. A., Naidoo J., Longgood J., Frantz D. E., Tambar U. K., Gardner K. H., Bruick R. K. (2013): Allosteric Inhibition of Hypoxia Inducible Factor-2 with Small Molecules. Nature Chemical Biology 9 271-276 Semenza G. L., Agani F., Booth G., Jo Forsythe J., Iyer N., Jiang B. H., Leung S., Roe R., Wiener C., Yu A. (1997): Structural and functional analysis of hypoxia-inducible factor 1. Kidney International 51 553-555

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Pisarenko, Irina: Interaktionsanalyse der Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktoren HIF-2α und ARNT unter Berücksichtigung der Einflussnahme durch den HIF-2α-Liganden N-(3-Chloro-5-fluorophenyl)-4-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-5-amine und verschiedener HIF-2α-Mutationen. 2018.

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