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RGD-Receptor with Enhanced Water Solubility

Hofmann, Johannes

The objective of this work was the development of a water-soluble receptor for small molecular weight peptides containing the RDG-sequence as a recognition unit. The focus was set on the synthesis of a receptor with a ditopic binding motif and the evaluation of its binding affinity towards RGD-peptides. Both binding motifs should be designed in a complementary fashion. Therewith it should be possible to recognize the negatively charged side chain of the aspartic acid residue and the positively charged guanidinium group which is part of the arginine amino acid simultaneously. Figure 5-1. Structures of the bicyclic diene 10 and the RGD-receptor 46. In a first approach the 1st generation RGD-receptor 46 (fig. 5 1) could be realized in a 22 step synthesis. Partially the synthesis could be managed via convergent reaction steps like the formation of the tweezer or the triazole. Some further improvements in the tweezer synthesis could be made. Especially a more efficient synthesis strategy of the diene 10 could be developed. The yield of the bicyclic diene 10 could be improved by the change of the polymerization inhibitor in the initial synthesis step significantly. In addition with the shortening from 6 to 4 synthesis steps the overall yield of the diene 10 (fig. 5 1) was improved from 15 % to almost 40 %. Additionally an easy access to un-symmetrical tweezers could be realized within this work. During the synthesis of the first RGD-receptor 46 the synthesis of the mono alkyne tweezer 31 (fig. 5 2) could be developed. But unluckily the water solubility of the 1st generation RGD-receptor (fig. 5 1) was too low and unsatisfying for further binding studies with RGD-peptides. Even the characterization of the receptor precursor 45 and of receptor 46 revealed some problems that were related to the poor water-solubility of molecule 46. Under acidic, slightly acidic and alkaline conditions the molecules trended to form aggregates that could be visualized nicely via AFM. With DLS measurements the size of the aggregates under almost neutral conditions could be confirmed. Figure 5-2. Both mono-alkynes the mono-alkyne tweezer 31 and the diphosphate mono-alkyne tweezer 50 were synthesized via a Williamson ether synthesis and an analogous Williamson ether synthesis respectively. In a second approach a supplemental water solubility enhancing group in combination with a reduced size of the aromatic backbone of the tweezer was considered. For the realization of a completely water-soluble RGD-receptor an access towards un-symmetrical tweezers and truncated tweezers containing two phosphate groups needed to be developed. The introduction of a second phosphate group yielded the water-soluble diphosphate mono-alkyne tweezer 50 and the guanidinium binding site 51. The synthesis of molecule 51 could be realized as a one pot synthesis starting with the diol 19b (fig. 5 3). In the final synthesis step the RGD-receptor 56 was assembled in a copper-catalyzed cyclisation reaction. This last reaction facilitated a smart linkage of both binding motifs in a convergent syntheses strategy. The low molecular weight RGD-receptor 56 was synthesized in an overall yield of 3 % with respect to the synthesis of molecule 51. Generally the syntheses of the basic building blocks followed the standard synthesis protocols. Some improvements with respect to the yield and the efficiency could be made. Especially the synthesis route of the tweezer building block was shortened by two reaction steps. The synthesis of azido pyrrole 32 revealed some stability problems. The fast decomposition of azido pyrrole 37 during the deprotection step could be circumvented by an introduction of the azide at the unprotected pyrrole 43. Figure 5-3. The synthesis of the truncated mono alkyne diphosphate tweezer 51 was carried out in a one pot synthesis. The convergent synthesis of the diphosphate mono-alkyne 51 with the pyrrole azide 32 was executed via a 1,3-dipolar cycloaddition. The characterization of both synthesized RGD-receptors turned out to be complicated. Due to intermolecular interactions caused by processes of self-assembly the NMR spectrum was influenced for example. The more functional groups became unprotected the more distinct the peak broadening appeared in the spectrum. Within the second approach the aim of a totally convergent synthesis strategy could be applied. This allowed an easier characterization of the separated building blocks until the last reaction step. The UV-binding studies of the receptor 56 under slightly acidic conditions could be carried without further problems. The evaluation of the complex stoichiometry via Job’s method yielded insignificant results so that host-guest systems with stoichiometry of a 1:1 were assumed. This new receptor showed somehow a specific recognition affinity towards cyclic RGD-peptides. This could be seen by an increase of the association constant from the penta-peptide P2 towards the hexa-peptide P3 and the linear RGD-peptide P1. The highest binding constants could be recorded using the linear RGD-tripeptide P1. Herewith an association constant of KA = 3.4*104 M-1 was found taking a 1:1 complex into account. Compared to the first synthetic RGD-receptor the KA value with linear RGD-peptide could be improved by two orders of magnitude. This first receptor was the trisphosphonate receptor developed by Schrader et al. (fig. 2 5). It showed even the same trend to form stronger complexes with the flexible and linear RGD peptide (KA = 1300 M-1) compared to the cyclic peptide cyclo(RGDfV) (KA = 700 M-1).43 Last mentioned receptor showed rather marginal affinity difference between the cyclic and the free RGD peptide. Only half an order of magnitude could be achieved in difference of selectivity. Whereas the newly developed water-soluble RGD-receptor 56 showed a slightly higher selectivity between the penta-peptide (KA = 4,300 M 1) towards linear peptide (KA = 34,000 M 1). One big advantage of the newly developed receptor synthesis is the flexibility in the linker length. Based on the concept of separated binding sites connected via a linker and a convergent synthesis this strategy enables a rather fast development of new receptor molecules. This method can be used efficiently to generate different RGD-receptors with dissimilar selectivity and binding properties towards different RGD-peptides more efficiently. Although the objective intended the synthesis of a RGD-receptor containing a full tweezer as binding site for guanidinium residue, it could be shown that a truncated version of the tweezer could afford easier synthesis impressively. Even solubility problems could be circumvented by the diminishment of the tweezer building block. Nevertheless the results of this work can be used to design tailor-made RGD-receptors by the additional usage of space demanding residues at the linker. Through the truncation of the tweezer and therefore the loss of the hydrophobic aromatic backbone the solubility should not suffer by further residue attachment. The introduction of small residues like methyl or ethyl-side chains for example might have some impact on the selectivity between different RGD-peptide due to their different conformation. For further research promising results can be expected. Especially when the selectivity of new RGD-receptors can be triggered easily the new receptors could be tested against integrin peptides like vitronectin or fibronectin. This route of research might lead in final application for pharmaceuticals or their evaluation, if they are based on RGD-recognition.

Die Zielsetzung dieser Arbeit war die Entwicklung eines wasserlöslichen Rezeptors zur Erkennung von niedermolekularen Peptiden, welche die RGD-Sequenz als Erkennungseinheit tragen. Im Focus standen die Synthese eines Rezeptors bestehend aus einem doppelten Bindungsmotiv sowie die Bestimmung seiner Bindungsaffinität gegenüber RGD-Peptiden. Beiden Bindungsmotive sollten in einer komplementären Art und Weise gestaltet sein. Dadurch sollte die simultane Erkennung der negativ geladenen Seitenkette der Asparaginsäure sowie die positiv geladene funktionelle Guanidiniumgruppe, die Teil der Aminosäure Arginin ist, ermöglicht werden. Abbildung 7-1. Struktur des bizyklischen Diens 10 und des RGD-Rezeptors 46. In einem ersten Ansatz wurde der RGD-Rezeptor 46 der ersten Generation in einer 22 stufige Synthese dargestellt (Abbildung 7 1). Teilweise konnte die Synthese über konvergente Reaktionen wie beispielsweise die Darstellung des Tweezers oder des Triazols durchgeführt werden. Weiterhin konnten Verbesserungen in der Tweezersynthese etabliert werden. Besonders zu erwähnen ist die effizientere Herstellung des Diens 10. So konnte die Ausbeute in der ersten Synthesestufe durch den Tausch des Polymerisations-Inhibitors deutlich gesteigert werden. In Kombination mit einer Syntheseverkürzung von 6 auf 4 Stufen konnte die Ausbeute von 15 % auf nahezu 40 % erhöht werden (Abbildung 7 1). Weiterhin konnte ein einfacher Zugang zu unsymmetrischen Tweezern innerhalb dieser Arbeit entwickelt werden. Während der Synthese des ersten RGD-Rezeptors 46 konnte ein Weg zum Mono Alkin Tweezer 31 (Abbildung 7 2) gefunden werden. Abbildung 7 2. Beide abgebildeten Mono-Alkine konnten mit Hilfe einer Williamson Ether Synthese bzw. einer analogen Williamson Ether Synthese hergestellt werden. Wie sich herausgestellt hatte, war die Wasserlöslichkeit des RGD-Rezeptors der ersten Generation für weitere Bindungsstudien mit RGD-Peptiden ungenügend (Abbildung 7 1). Selbst die Charakterisierung des Rezeptor-Vorgängers 45 und des Rezeptors 46 zeigte einige Probleme, die im Zusammenhang mit der schlechten Löslichkeit im Allgemeinen zu sehen sind. Unter sauren, leicht sauren wie auch basischen Bedingungen zeigte sich, dass Aggregate gebildet wurden. Diese konnten mittels AFM veranschaulicht werden. Mit Hilfe von DLS-Messungen konnte die Größe der gebildeten Aggregate unter nahezu neutralen Bedingungen bestätigt werden. In einem zweiten Ansatz wurde über eine weitere Phosphatgruppe in Zusammenhang mit einer Größenreduzierung des aromatischen Grundgerüstes des Tweezer-Moleküls nachgedacht. Für die Realisierung eines komplett wasserlöslichen RGD-Rezeptors musste eine Synthese von unsymmetrischen Tweezern wie auch deren kleineren Homologen entwickelt werden. Die Einführung einer zweiten Phosphatgruppe ergab den wasserlöslichen Diphosphat-Tweezer 50 und die Bindungsstelle (51) für die Guanidiniumfunktion. Dabei konnte die Synthese des verkürzten Tweezers 51 sogar als Eintopf-Reaktion ausgehend vom Diol 19b (Abbildung 7 3) durchgeführt werden. Im letzten Syntheseschritt wurde der RGD-Rezeptor 56 durch eine kupfer-katalysierte Cycloadditions-Reaktion zusammengefügt. Dieser letzte Reaktionsschritt ermöglichte eine elegante Verknüpfung beider Bindungsmotive in Verbindung mit einer konvergenten Synthesestrategie. Der niedermolekulare RGD-Rezeptor 56 wurde in einer Gesamtausbeute von 3 % in Bezug auf Molekül 51 synthetisiert. Im Allgemeinen wurden die Synthesen der Grundbausteine nach den protokollierten Standard¬synthesen durchgeführt. Dabei konnten einige Verbesserungen mit Hinblick auf Ausbeute und Effizienz gemacht werden. Besonders die Synthese des Tweezerbausteines konnte um 2 Reaktionsschritte verkürzt werden. Bei der Synthese des Pyrrolbausteines 32 zeigten sich Stabilitätsprobleme. Eine schnelle Zersetzung des Pyrrols 37 bei der Entschützung der Guanidin-Funktion konnten durch die spätere Einführung des Azides am ungeschützten Pyrrol 43 umgangen werden. Abbildung 7 3. Die konvergente Synthese zwischen dem Diphosphat Mono-Alkin 51 und dem Pyrrolazid 32 wurde mit Hilfe einer 1,3-dipolaren Cycloaddition durchgeführt. Eine Charakterisierung beider hergestellten RGD-Rezeptoren stellte sich als schwierig heraus. Aufgrund intermolekularer Wechselwirkungen durch Selbstassem-blierungsprozesse wurden beispielsweise NMR-Spektren beeinflusst. Je mehr funktionelle entschützt vorlagen, desto deutlicher war eine Peakverbreiterung in den Spektren zu sehen. Die UV-Bindungsstudien des RGD-Rezeptor 56 konnten ohne weitere Löslichkeitsprobleme unter leicht sauren Bedingungen durchgeführt werden. Die Ermittlung der Komplexstöchiometrie mittels der Methode nach Job lieferte nicht besonders signifikante Ergebnisse. Daher wurden 1:1 Stöchiometrien für die Wirt-Gast-Systeme angenommen. Dieser neue Rezeptor zeigte eindrucksvoll eine spezifische Erkennungsaffinität gegenüber dem linearen RGD-Peptid und zwischen den zyklischen RGD-Peptiden, die von Kessler et al. entwickelt wurden. Das konnte durch einen Anstieg der Bindungskonstante vom zyklischen Penta-Peptid P2 über das zyklische Hexa-Peptid P3 bis hin zum linearen RGD-Peptid P1 gezeigt werden. Die größte Bindungskonstante wurde mit dem Peptid P1 erzielt, mit dem unter Annahme eines 1:1 Komplexes eine Konstante von KA = 3.4*104 M-1 gefunden werden konnte. Im Vergleich zum ersten synthetischen RGD-Rezeptor konnte die Bindungskonstante mit einem linearen RGD-Peptid um zwei Größenordnungen verbessert werden. Dieser erste Rezeptor war der von Schrader et al. entwickelte Triphosphonat-Rezeptor (Abbildung 2 5). Er verdeutlichte den gleichen Trend stärkere Komplexe mit einem flexibleren und linearen RGD-Peptid (KA = 1300 M-1) im Vergleich zum zyklischen Peptid cyclo(RGDfV) (KA = 700 M-1) zu bilden.43 Der zuletzt genannte Rezeptor wies einen geringen Affinitätsunterschied zwischen dem zyklischem und dem freiem RGD-Peptid auf. Nur eine halbe Größenordnung an Selektivitätsunterschied wurden damit berichtet. Dagegen zeigte der in dieser Arbeit neue entwickelte wasserlösliche RGD-Rezeptor 56 von Natur aus eine höhere Selektivität zwischen dem Penta-Peptid (KA = 4,300 M 1) und dem linearen RGD (KA = 34,000 M 1). Ein besonders großer Vorteil des neu entwickelten Rezeptors ist seine Flexibilität durch die variable Länge des Linker-Moleküls. Basierend auf dem Konzept von separierten Bindungsstellen, die über ein Linker-Molekül verknüpft sind, und einer konvergenten Synthese können schnell neuen RGD-Rezeptoren entwickelt werden. Diese Methode kann effizient zur Entwicklung verschiedener RGD-Rezeptoren mit unterschiedlichen Selektivitäts- und Bindungseigenschaften gegenüber verschiedenen RGD-Peptiden verwendet werden. Trotz der zuvor angestrebten Zielsetzung, einen RGD-Rezeptor mit einem kompletten Tweezer als Guanidium-Bindungsstelle zu entwickeln, konnte eindrucksvoll gezeigt werden, dass eine verkürzte Version des Tweezers eine einfachere Synthese bedeutet. Besonders die Löslichkeitsproblematik konnte damit umgangen werden. Letztlich können die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen maßgeschneiderte RGD-Rezeptoren durch die Verwendung von raumfüllenden Resten am Linker-Molekül zu kreieren. Durch die Verkleinerung des Tweezer-Moleküls und dem damit verbundenen Verlust des hydrophoben aromatischen Grundgerüstes können weitere Reste ohne größeren Einfluss auf die Löslichkeit eingeführt werden. Die Einführung von beispielsweise kleineren Resten wie Methyl oder Ethyl-Seitenketten kann einen Einfluss auf die Selektivität zwischen unterschiedlichen RGD-Peptiden haben. Für eine weitere Forschung können erfolgreiche Ergebnisse erwartet werden. Besonders wenn eine Einstellung der Selektivität möglich ist, könnten Tests gegenüber größeren Proteinen wie Vitronectin oder Fibronectin durchgeführt werden. Dieser Ansatz ermöglicht dann einmal die Anwendung in Arzneimitteln oder deren Bewertung, wenn diese RGD-basiert sind.  

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Hofmann, Johannes: RGD-Receptor with Enhanced Water Solubility. 2017.

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