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Multivalente Liganden mit Anionen-Bindungsmotiv als Stabilisatoren von Protein-Protein-Interaktionen und als Transfektionsvektoren

Bartsch, Lina

Im Fokus der vorliegenden Promotionsarbeit standen die Entwicklung und Untersuchung multivalenter Liganden als Stabilisatoren von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) und als künstliche Gentransfektionsvektoren. Über molekulare Erkennungsprozesse sollten die biologischen Zielstrukturen supramolekular adressiert werden. Die Liganden sind dendritisch aufgebaute, polykationische Peptide. Als Grundgerüst wurden Lysine miteinander verknüpft, um zwei-, drei- oder vier-armige Verbindungen zu generieren. Als Seitenarme wurden verschiedene Peptidsequenzen bestehend aus Lysin, Tryptophan, Phenylalanin und Arginin, die über Glycin mit dem Grundgerüst verbunden wurden, verwendet. Das Guanidiniocarbonylpyrrol (GCP) sollte zusätzlich als künstliches Anionen-Bindungsmotiv verwendet werden. Für die Untersuchung der multivalenten Liganden als Modulatoren von Protein-Protein-Interaktionen wurde als Ziel die Wechselwirkungen zwischen dem 14-3-3ζ-Protein mit C-RAF und dem Tau Protein gewählt. Mittels Fluoreszenzpolarisations-Experimenten, DLS, nativer PAGE, ITC und SPR wurden die künstlichen Liganden untersucht. Insgesamt konnte erstmals durch Kombination von Multivalenz mit einer künstlichen Erkennungseinheit eine neue Klasse von Liganden vorgestellt werden, die die Interaktion zweier Proteine (14-3-3ζ/C-RAF und 14-3-3ζ/Tau Protein) stabilisiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass auf die Stabilisierung sowohl die Multivalenz der Liganden als auch das auf Anionen-Erkennung angepasste GCP-Bindungsmotiv einen maßgeblichen und gewinnbringenden Einfluss nehmen. Die Untersuchungen der synthetischen Liganden im letzten Teil dieser Arbeit bezogen sich auf die Bindung von DNS und den Transport von genetischem Material ins Zellinnere. Dafür wurden die multivalenten Liganden mittels DLS, EB-Verdrängungsassays, ITC, AFM und Transfektionsexperimenten untersucht. Mit den hier vorgestellten multivalenten Liganden konnte eine neue Verbindungsklasse nicht-viraler Genfähren identifiziert werden. Die Transfektionsexperimente zeigen eindrucksvoll, dass nur die GCP-tragende Verbindung Zellen transfizieren kann. Somit kann ein Ligand durch den Einbau einer künstlichen Erkennungseinheit maßgeblich verbessert werden. Die Verwendung des GCP-Bindungsmotivs stellt daher ein gewinnbringendes Werkzeug für Weiterentwicklung von Transfektionsvektoren dar. Anhand der Arbeiten wurde das große Potential rational entworfener, multivalenter Liganden, die die künstliche Anionen-Erkennungseinheit GCP tragen, eindrucksvoll aufgezeigt. Eine Erhöhung der Bindungsmultivalenz in Kombination mit dem künstlichen Anionen-Bindungsmotivs sorgte sowohl für eine verbesserte Stabilisierung der PPI als auch für eine erhöhte Transfektionseffizienz der entwickelten Vektoren.

The research focus of this thesis was centered on the development and investigation of multivalent ligands as stabilizers of protein protein interactions (PPI) and as artificial gene transfection vectors. Biological targets should be addressed supramolecular due to molecular recognition processes. These ligands are polycationic peptides built dendritically. As a scaffold several lysines were linked to obtain two-, three- or four-armed compounds. As sidechains different peptide sequences were used containing lysine, tryptophane, phenylalanine and arginine, which were connected to the scaffold via glycine as a linker. Additionally guanidiniocarbonylpyrrole (GCP) was used as an artificial anion binding motif. For the investigation of multivalent ligands as modulators of protein protein interactions the interaction between lightly acidic 14-3-3ζ protein and C-RAF or Tau Protein were chosen. By the use of fluorescence polarisation experiments, DLS, native PAGE and SPR the ligands were tested to influence the interactions. For the first time, however, a new class of ligands were introduced combining multivalency with an artificial recognition unit to stabilize the interation of two proteins (14-3-3ζ/C-RAF and 14-3-3ζ/Tau Protein). It was proven that the stabilisation effect was influenced essentially and advantageously by both multivalency of the ligands and especially the artificial and well designed anion binding motif GCP. In the last part of this thesis, the examinations of the synthetic ligands involved DNA binding properties and the ability to transport genetic material into cells. Thus the ligands were tested in DLS, EB-displacement assays, ITC, AFM and transfektion experiments. With the examination of the multivalent ligand a new class of non-viral gene delivery system was identified. Transfection experiments showed impressively only GCP-containing ligand to transfect cells. Thus, ligands could be improved essentially by the integration of artificial recognition units. The use of binding motif GCP is a powerfull tool for the development of transfection vectors. On the basis of these results demonstrate impressively the great capability of rational designed, multivalent ligands, which include the artificial anion recognition unit GCP. Increasing the binding valency of the ligand combined with the GCP-moiety improved both the stabilisation effect on PPIs as well as the transfection efficiency of the developed vectors.

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Bartsch, Lina: Multivalente Liganden mit Anionen-Bindungsmotiv als Stabilisatoren von Protein-Protein-Interaktionen und als Transfektionsvektoren. 2017.

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