Analysis of a novel allosteric inhibitor of the AAA+ ATPase p97 and its mechanism
The hexameric AAA+ ATPase p97/VCP is an abundant enzyme found in the cytoplasm and the nucleus and an essential part of protein homeostasis. In concert with the proteasome, p97 is involved in the degradation of ubiquitinated proteins. These substrate proteins can be unfolded by p97 using the energy provided by ATP hydrolysis. The enzyme harbors two ATPase domains, D1 and D2, that regulate the activity and conformation of p97. To understand the mechanism and function of p97 on the molecular and cellular level, inhibitors of p97 emerged as invaluable research tools that facilitated numerous experiments. Furthermore, a p97 inhibitor is currently in clinical trials to treat cancer types like multiple myeloma that rely on an effective ubiquitin proteasome system to deal with stress caused by aberrant or excessively synthetized proteins.
Our goal was to evaluate a new compound as an inhibitor of p97 that emerged from a high throughput screen. We confirmed that the compound called I8 inhibits purified p97 reversibly with an IC50 of 7 μM. To test the selectivity of I8, we used the AAA+ ATPases NSF and VPS4B. NSF is essential for trafficking and secretion and VPS4B is a key factor for reverse topology abscission events at membranes. We found that I8 has weak activity against NSF, whereas VPS4B is inhibited with an IC50 of 0.7 μM. Subsequently, we showed that I8 inhibits both ATPases p97 and VPS4B via an allosteric mechanism. Moreover, our study implicated a non-competitive inhibition, which is binding between I8 and p97 independently of ATP binding. Structure activity relationship studies revealed that the fluorinated bisphenyl and tetrahydrocarbazole group are important structural features of I8. We investigated effects of I8 on the structure of p97 and found that it does not influence the hexamerization but increases the stability of the D2 domain against degradation. Via mass spectrometry analysis and comparison of I8 with known p97 inhibitors, we found potential homologous binding sites of I8 in the p97 D1 and D2 domains and in VPS4B. The comparison revealed a possible shared inhibitory pathway in p97 between a diverse set of inhibitors that disrupts the inter-domain communication in the D2 domains.
In summary, our characterization of a novel ATPase inhibitor identified a possible general mechanism of action common to different classes of inhibitors.
Die AAA+ ATPase p97/VCP ist ein hexameres Enzym, das in hoher Anzahl im Zytoplasma und Zellkern vorkommt und einen essentiellen Beitrag zur Proteinhomöostase leistet. Zusammen mit dem Proteasom ist p97 am Abbau von ubiquitinierten Proteinen beteiligt, die von p97 unter ATP Verbrauch entfaltet werden können. Das Enzym besitzt zwei ATPase-Domänen, D1 und D2, die die Aktivität und Konformation von p97 regulieren. Um den Mechanismus und die Funktion von p97 auf der molekularen und zellulären Ebene zu verstehen, dienen p97 Inhibitoren als wertvolle Forschungsinstrumente, die zahlreiche Experimente ermöglicht und erleichtert haben. Einer dieser Inhibitoren wird außerdem in klinischen Tests gegen Krebstypen wie das Multiple Myelom eingesetzten, die ein effektives Ubiquitin Proteasome System benötigen um mit Stress umzugehen, der von falsch gefalteten oder überzähligen Proteinen verursacht wird.
In dieser Studie untersuchten wir eine neue Substanz, die als p97 Inhibitor in einem Hochdurchsatz-Screening gefunden wurde. Wir konnten bestätigen, dass die I8 genannte Substanz aufgereinigtes p97 reversibel mit einem IC50 Wert von 7 μM inhibiert. Um die Selektivität zu überprüfen, nutzten wir die mit p97 verwandten AAA+ ATPasen NSF und VPS4B. NSF ist ein essentieller Bestandteil des Transport- und Sekretionssytems, VPS4B ist ein Schlüsselelement in Abschnürungsvorgängen reverser Topologie von Membranen. Wir fanden heraus, dass I8 nur eine schwache Aktivität gegen NSF hat, VPS4B jedoch mit eine IC50 von 0,7 μM inhibiert. Daran anschließend zeigten wir, dass die ATPasen p97 und VPS4B durch einen allosterischen Mechanismus inhibiert werden. Außerdem deutete unsere Studie eine nicht-kompetitive Inhibition an, das heißt eine Bindung zwischen I8 und p97 unabhängig von der ATP Bindung. Untersuchungen zur Struktur-Wirkbeziehung zeigten, dass die fluorierte Bisphenyl- und Tetrahydrocarbazolgruppe wichtige Teile des I8 Moleküls darstellen. Wir untersuchten den Einfluss von I8 auf die Struktur von p97 und fanden heraus, dass es nicht die Hexamerisierung beeinträchtigt aber die D2 Domäne gegen Verdau schützt. Durch eine massenspektrometrische Analyse und dem Vergleich von I8 mit anderen p97 Inhibitoren fanden wir eine mögliche homologe Bindestelle in den beiden p97 ATPase Domänen und in VPS4B. Dieser Vergleich zeigte auch einen möglichen Signalweg auf, der von unterschiedlichen Inhibitoren genutzt wird, um die Kommunikation zwischen den D2 Domänen zu stören.
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