Molecular basics for T cell resistance of malignant melanoma

Melanoma is one of the most aggressive cancers due to an early dissemination of tumor cells and thus, a high metastatic rate leading to death. Simultaneously, melanoma cells exhibit a high intrinsic immunogenicity that is currently exploited successfully in different immunotherapeutic approaches including antibody based immune checkpoint blockade and adoptive T cell therapy, marking an impressive breakthrough in the treatment of this otherwise treatment-resistant disease. Nonetheless, only a subset of patients shows responsiveness to immunotherapy, pointing to tumor immune escape mechanisms as described for many other solid malignancies. A better understanding of the evolution of melanoma escape variants in the course of disease progression and the underlying molecular mechanisms should allow improving immune therapeutic strategies for melanoma patients, also with regard to personalized medicine. The aim of this thesis was (I) to gain deeper insight into the mechanisms underlying melanoma escape from CD8+ T cell recognition and (II) to study the recognition and killing of melanoma cells by autologous CD4+ T cells as alternative anti-tumor effector cells apart from CD8+ T cells. To achieve this, studies on several melanoma model systems were performed consisting of tissue, corresponding cell lines and autologous T cells.
The first two manuscripts included in this thesis characterize the CD8+ T cell immunogenicity of melanoma cells obtained from consecutive metastases of two patient models. In one patient system, a progressive loss of immunogenicity and finally complete T cell resistance of melanoma cells were observed. The latter was due to a MHC class I negative phenotype of the tumor cells caused by alterations in the B2M gene. In the second patient system, different resistance mechanisms were detectable in different metastases. Tumor cells from one lesion lost expression of specific T cell antigens due to dedifferentiation whereas melanoma cells from additional three metastases showed either haplotype loss or a complete loss of MHC class I expression, rendering cells invisible to CD8+ T cells.
The third manuscript then addresses the expression of MHC class II molecules on melanoma cells as a prerequisite for the development of CD4+ T cell based therapies. A strong heterogeneity of MHC class II expression was observed for melanoma tissues and cell lines from different patients but also among cell lines from consecutive metastases of
one patient. In the presence of constitutive or IFN induced MHC class II expression, autologous CD4+ T cells were basically capable of recognizing melanoma cells and some of these T cells showed cytolytic activity. However, melanoma cells could also escape from CD4+ T cell recognition by acquired genetic defects in the IFN signaling pathway and epigenetic silencing of the MHC class II transcriptional regulator CIITA, allowing melanoma cells to maintain their MHC class II negative phenotype in the presence of IFN.
Multiple studies have accumulated evidences for immune escape mechanisms of melanoma cells. The presented studies demonstrated the evolution of CD8+ T cell resistant metastases within different patient models, presumably allowing escape from tumor latency and progression of disease. Additionally, it was demonstrated that a subgroup of CD4+ T cells can exert cytolytic activity against autologous melanoma cells and to some extend contribute to direct anti-tumor immunity. However, also in this case melanoma cells can evolve to escape from CD4+ T cell recognition. Thus, monitoring of immune-related alterations in melanoma cells, as presented in this work, could be of value for treatment decision.

Das maligne Melanom ist aufgrund seiner frühen Ablösung von Krebszellen und der daraus folgenden hohen Metastasierungsrate eine der tödlichsten Krebsarten. Gleichzeitig besitzt das Melanom eine hohe intrinsische Immunogenität, die die Grundlage für diverse immuntherapeutische Ansätze bildet, wie beispielsweise die Antikörper-basierte Blockade immun-inhibitorischer Signale oder der Transfer tumorspezifischer T Zellen. Bei der Behandlung des ansonsten therapieresistenten Melanoms stellen diese Ansätze einen großen Durchbruch dar, jedoch spricht nur ein Teil der Patienten auf die Immuntherapie an. Untersuchungen im Melanom und anderen Tumorentitäten weisen darauf hin, dass unter dem Druck des Immunsystems Varianten von Krebszellen entstehen, die sich der Kontrolle durch Immunzellen entziehen. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen sowie der Evolution solcher „immune escape“ Varianten während des Krankheitsverlaufs ist elementar, um die Verbesserung immuntherapeutischer Strategien zu ermöglichen. Das Ziel dieser Arbeit war (I) die Charakterisierung der dem Melanom zugrundeliegende Mechanismen des „immune escapes“ gegenüber CD8+ T Zellen während des Krankheitsverlaufs und (II) die Untersuchung der Erkennung und des Tötens von Melanomzellen durch autologe CD4+ T Zellen als alternative Effektorzellen neben CD8+ T Zellen. Um einen Einblick in molekulare Mechanismen zu bekommen, die zu einem Verlust der Immunogenität von Tumoren eines Patienten führen, wurden mehrere Patientensysteme benutzt, die aus Gewebe, Zelllinien verschiedener Metastasen und autologen T Zellen bestehen.
Die ersten beiden Manuskripte befassen sich mit Immun-Verlust-Varianten konsekutiver Metastasen zweier Melanompatienten. In einem Patientensystem ist ein progressiver Verlust der Immunogenität zu beobachten, der zu einer kompletten CD8+ T Zellresistenz einer metastatischen Läsion aufgrund eines MHC Klasse I negativen Phänotyps führt, hervorgerufen durch graduelle genetische Veränderungen des B2M Gens. Im zweiten Patientensystem sind unterschiedliche Resistenzmechanismen in verschiedenen Metastasen zu beobachten. Während eine Metastase den Verlust von Antigenen durch Dedifferenzierung aufweist, zeigen die anderen Metastasen einen Haplotyp-Verlust von MHC Klasse I oder einen kompletten Verlust der MHC Klasse I Expression, resultierend in einer partiellen oder kompletten Resistenz gegenüber CD8+ T Zellen.
Das dritte Manuskript charakterisiert die Expression von MHC Klasse II Molekülen auf Melanomzellen als Voraussetzung für die Entwicklung CD4+ T Zell-basierter Therapien. Untersuchungen in Tumorgewebe und an Zelllinien zeigen, dass MHC Klasse II heterogen innerhalb eines Tumors und zwischen verschiedenen Metastasen eines Patienten exprimiert wird. In vitro expandierte tumor-spezifische CD4+ T Zellen erkennen Melanomzellen mit konstitutiver als auch IFN induzierter MHC Klasse II Expression und einige dieser CD4+ T Zellen zeigen einen cytotoxischen Phänotyp. Allerdings wird diese Tumorerkennung durch genetische Defekte im IFN Signalweg sowie durch epigenetische Veränderung des MHCII-Transaktivators CIITA limitiert, da diese Melanomzellen einen MHC Klasse II negativen Phänotypen auch in Anwesenheit von IFN behalten.
Zahlreiche Publikationen konnten zeigen, dass „immune-escape“ Mechanismen Melanomzellen gegenüber cytotoxischen CD8+ T Zellen unsichtbar werden lassen. Die ersten beiden Studien dieser Arbeit zeigen deutlich die Evolution von CD8+ T Zell-Resistenzmechanismen zwischen Metastasen eines Melanompatienten, die vermutlich zum Ende der Tumor-Latenz und letztendlich zum Fortschreiten der Erkrankung führen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass eine Subgruppe von CD4+ T Zellen eine cytotoxische Aktivität gegenüber autologen Melanomzellen aufweisen können und somit zu einer direkten Antitumor-Immunität beitragen können. Allerdings können Melanomzellen auch in diesem Fall Resistenzmechanismen gegenüber CD4+ T Zellen entwickeln. Dementsprechend kann das Beobachten immunologischer Charakteristika, wie in diesem Manuskript beschrieben, wertvoll für Therapieentscheidungen von Krebspatienten sein.

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