Etablierung und Weiterentwicklung einer Methode zur hochauflösenden Untersuchung des Phosphorylierungszustandes der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen ERK1 und ERK2

Kraus, Inga

Fehlregulationen der ERK1/2-Signalkaskade könnten nicht nur in der Onkogenese, sondern auch im Kontext der Alzheimer-Krankheit und der Amyothrophen Lateralsklerose involviert sein (Kim und Choi, 2010; Deschenes-Simard et al., 2014). Vollständig aktiviert werden die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen ERK1 und ERK2 über eine doppelte Phosphorylierung an einem konservierten Threonin-Glutamat-Tyrosin (TEY)-Motiv. Monophosphorylierte Isoformen von ERK1/2 sind ebenfalls in lebenden Zellen nachzuweisen und besitzen in vitro bei physiologischen ATP-Konzentrationen eine messbare Kinaseaktivität. Eine hochauflösende Trennung und Detektion der unphosphorylierten, einfach- und zweifach-phosphorylierten Isoformen von ERK1 und ERK2 sowie ihre semi-quantitative Analyse sind durch den Einsatz der isoelektrischen Fokussierung in Mikrokapillaren mit nachgeschaltetem Immunnachweis (CIEF-Immunoassay) möglich. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein optimiertes Arbeitsprotokoll entwickelt, um die Phosphorylierung von ERK1/2 in Zelllysaten mit dem CIEF-Immunoassay zu analysieren. Es wurden verschiedene Lysesysteme getestet, wobei sich herausstellte, dass Reduktionsmittel die ERK1/2-Detektion erheblich beeinflussen können. Das kommerziell erhältliche M-PER-Reagenz eignete sich am besten, da es eine höhere Effizienz zur Lyse der Zellkerne zeigte als andere Lysepuffer, keine Reduktionsmittel enthielt und eine hohe Ausbeute an phosphorylierten ERK1/2-Isoformen ermöglichte. Die Reproduzierbarkeit der relativen Quantifizierungen im CIEF-Immunoassay erwies sich für solche Signale als akzeptabel (Variationskoeffizient < 15 %), deren relativer Flächeninhalt mindestens 1 % der aufsummierten Flächeninhalte aller ERK1- bzw. ERK2-Signale betrug. Insgesamt lagen die Abweichungen in einem Bereich, der in der Regel sowohl einen Vergleich von Proben innerhalb eines Laufes als auch zwischen mehreren Läufen erlaubte. Als wichtige Weiterentwicklung der bisher publizierten analytischen Möglichkeiten des verwendeten CIEF-Immunoassays gelang im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit die zusätzliche Unterscheidung und eindeutige Zuordnung von Threonin-monophosphoryliertem und Tyrosin-monophosphoryliertem ERK1 und ERK2. Dieser Nachweis wurde durch die Kombination synthetischer phospho-ERK1/2-Peptide mit verschiedenen anti-phospho-ERK1/2-Antikörpern in kompetitiven Blockierungsexperimenten, welche in dieser Form erstmalig im CIEF-Immunoassay eingesetzt wurden, erreicht. Um die praktische Anwendbarkeit des optimierten Arbeits- und Analyseprotokolls zu überprüfen, wurde im zweiten Teil der Arbeit zunächst exemplarisch die Kinetik der ERK1/2-Phosphorylierung in den Zelllinien SH-SY5Y und THP-1 sowie in humanen peripheren mononukleären Blutzellen nach Stimulation der Zellen zeitabhängig untersucht. Die ERK1/2-phospho-Form-Verteilung schien dabei abhängig vom jeweiligen Zelltyp und eingesetzten Aktivator zu variieren. Die erfolgreich etablierte Methode wurde schließlich in Form einer orientierenden Pilot-Studie mit einer klinischen Kohorte an humanen peripheren mononukleären Blutzellen von Patienten mit Alzheimer-Demenz, leichten kognititven Einschränkungen, Amyotropher Lateralsklerose und nicht-dementen Kontrollprobanden angewandt. Trotz der sehr kleinen Stichprobe konnten statistisch signifikante Gruppenunterschiede, nach erfolgter Aktivierung durch Gabe eines Stimulus, hinsichtlich der Inaktivierung (Dephosphorylierung) der doppelt-phosphorylierten und Threonin-monophosphorylierten Formen von ERK1 beobachtet werden. Dies könnte auf eine mögliche krankheitsassoziierte Veränderung in der Aktivität von Phosphatasen hinweisen. Die Ergebnisse sind allerdings aufgrund der kleinen Gruppengrößen als vorläufig zu betrachten. Für den Einsatz mit einer größeren Kohorte ist die Optimierung weiterer Parameter erforderlich. Insgesamt ermöglicht der CIEF-Immunoassay eine detaillierte Studie zur relativen Verteilung der phospho-ERK1/2-Isoformen in Zelllysaten.

The dysregulation of the ERK1/2 signalling cascade appears to be involved not only in oncogenesis but also in the context of Alzheimer’s disease and amyotrophic lateral sclerosis. The mitogen activated protein kinases ERK1 and ERK2 are fully activated by dual phosphorylation at a conserved threonine-glutamate-tyrosine (TEY) motif. Monophosphorylated isoforms of ERK1/2 are also present in living cells and have appreciable kinase activities in vitro at physiological ATP concentrations. The highly sensitive detection and differentiation of the unphosphorylated, monophosphorylated and diphosphorylated isoforms of ERK1 and ERK2 as well as their semi-quantitative analysis can be achieved by capillary isoelectric focussing followed by immunodetection (CIEF-immunoassay). In the first part of the present work an optimised working procedure was elaborated for the detailed analysis of phosphorylation of ERK1/2 in cell lysates by CIEF-immunoassay. When different lysing systems were tested, it turned out, that reducing agents can substantially influence the ERK1/2 detection. The commercially available M-PER reagent was most suitable as it possessed higher efficiency in lysing nuclei than other buffers, it contained no reducing agents and offered a high recovery of ERK1/2-phospho-forms in the resulting cell lysates. The reproducibility of the relative quantifications in the CIEF-immunoassay was acceptable (coefficient of variation < 15 %) for signals with a relative abundancy greater than 1 % of the added abundancies of all ERK1 and ERK2 signals, respectively. Generally, the observed variation allowed for reasonable comparison of samples within the same assay as well as in different, independent assays. An important improvement of previously published analytical possibilities of the CIEF-Immunoassay is the additional differentiation and classification of the threonine- and tyrosine-monophosphorylated isoforms of ERK1 and ERK2, which is presented within this work. The differentiation and unequivocal peak identification were achieved with a combination of synthetic phospho-ERK1/2 peptides and several anti-phospho-ERK1/2 antibodies in competitive blocking experiments, which were performed for the first time in the CIEF-Immunoassay in this form. As a proof of principle the optimised standard operating procedures were applied to exemplarily analyse the kinetics of ERK1/2 phosphorylation and the time dependent occurrence of phospho-ERK1/2 after stimulation in SH-SY5Y and THP-1 cell lines as well as in peripheral blood mononuclear cells in the second part of the work. The ERK1/2-phospho-form distribution seemed to depend on the particular cell type and the applied stimulus. The optimised method was furthermore applied to an orienting pilot study on human peripheral blood mononuclear cells from a small clinical cohort of patients with Alzheimer’s disease, mild cognitive impairment, amyotrophic lateral sclerosis and non-demented controls. Despite of the very small sample size, statistically significant differences between the diagnostic groups could be observed, after activation by applying a stimulus, for the inactivation (dephosphorylation) of the diphosphorylated and threonine-monophosphorylated forms of ERK1. These changes could possibly be linked to a disease related dysregulation of phosphatase activity. Due to the small size of the groups within this study, the results have to be considered as preliminary. For additional confirmative studies with a greater sample size an optimisation of several parameters will be necessary. Altogether, the CIEF-immunoassay enables detailed studies concerning the relative ERK1/2-phospho-form distribution in cell lysates.

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Kraus, Inga: Etablierung und Weiterentwicklung einer Methode zur hochauflösenden Untersuchung des Phosphorylierungszustandes der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen ERK1 und ERK2. 2016.

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