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The influence of chromatin structure on DNA double strand break repair pathway choice

Demond, Marilen

Higher eukaryotes have evolved mechanistically distinct repair pathways to remove DSBs from the genome: c-NHEJ, HRR and alt-EJ. The probability to faithfully repair the DSB is strongly dependent on the utilized repair pathway and HRR is the only known error-free repair pathway, whereas c-NHEJ and especially alt-EJ are known to induce sequence alterations or even translocations. How the repair pathway selection is regulated in the cell is currently under investigation and in the present work we specifically focused on HRR activity regulation and on chromatin structure as a parameter influencing repair pathway choice. DSB repair was systematically evaluated by analyzing the formation of different IRIF in heterochromatic and euchromatic chromatin regions and we concentrated our analysis on late S and G2 phase cells to track HRR activity. The results of γH2AX foci formation demonstrated clear incidence in EC and HC regions. To specifically visualize DNA end resection and HRR activity, we examined formation of RPA and Rad51 foci. We demonstrated that the choice towards HRR is not regulated by chromatin structure. Indeed, we observed proportional distribution of RPA and Rad51 foci in EC and HC regions. Moreover, the numbers of Rad51 foci saturated with increasing radiation dose independently of chromatin condensation status, supporting recent findings from our laboratory revealing a saturation of HRR with increasing radiation dose. However, RPA foci in HC and EC regions increased almost linearly, demonstrating active resection at high doses, which suggests a repair pathway switch towards error-prone repair mechanisms. The dose response curves of 53BP1 foci show a similar saturation as Rad51 foci and we observed persistence of 53BP1 foci after high radiation doses. These findings suggest a regulating role of 53BP1 in the process of HRR saturation. In order to study DSB repair under altered chromatin condensation conditions, we applied hypertonic or hypotonic treatments. Hypertonic treatment causes an increase in chromatin condensation and impaired DSB repair. Although we detected enlarged γH2AX foci formation in hypertonically treated cells, the formation of pATM, 53BP1, RPA and Rad51 foci was almost completely suppressed. Treatment in hypotonic medium, on the other hand relaxed chromatin and was better tolerated during DSB repair. This was shown by the almost unaltered formation of 53BP1, pATM and RPA foci. Unexpectedly, γH2AX foci formation was suppressed in hypotonically treated cells, which indicates that 53BP1 and RPA are able to accumulate at the break site without extensive phosphorylation of H2AX. With the help of repair reporter assays we detected the highest repair reduction with the HRR reporter assay under hypertonic and hypotonic conditions, demonstrating that HRR is highly sensitive to changes in chromatin structure. Notably, inhibition of the histone methyltransferase SUV39H1 with chaetocin also strongly suppressed HRR. Thus, the results obtained in the present thesis strongly support an HRR saturation with increasing radiation dose and demonstrate a regulatory role of 53BP1 in this process. Moreover, chromatin modifications were successfully established as key regulatory parameters of HRR.

Höhere Eukaryoten haben mechanistisch unterschiedliche Reparaturwege entwickelt um DNA- Doppelstrangbrüche aus dem Genom zu entfernen: c-NHEJ, HRR und alt-EJ. Die Wahrscheinlichkeit einer fehlerfreien Reparatur ist stark abhängig von dem verwendeten Reparaturweg und HRR ist der einzige bekannte fehlerfreie Reparaturweg, während c-NHEJ und vor allem alt-EJ dafür bekannt sind, Sequenzänderungen oder auch Translokationen zu induzieren. Wie die Reparaturwegswahl in der Zelle reguliert wird, ist bislang noch nicht vollständig geklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde insbesondere die Aktivierung von HRR untersucht, mit Hinblick auf die Chromatinstruktur als regulierender Faktor der Reparaturwegswahl. Hierzu wurde die Bildung von verschiedenen strahlen-induzierten Foci (IRIF) in heterochromatischen und euchromatischen Chromatinregionen systematisch untersucht und durch die fokussierte Analyse von späten S und G2 Phase Zellen konnte die Aktivität von HRR gezielt verfolgt werden. Die Ergebnisse der γH2AX Foci-Bildung zeigten deutlich, dass Doppelstrangbrüche mit gleicher Wahrscheinlichkeit in euchromatischen und heterochromatischen Chromatinstrukturen induziert wurden. Um speziell die DNA End-Resektion und HRR-Aktivität zu analysieren, untersuchten wir die Bildung von RPA und Rad51 Foci. Wir konnten zeigen, dass die Reparaturwegswahl zugunsten HRR nicht von der Chromatinstruktur beeinflusst wird. Tatsächlich beobachteten wir eine gleichmäßige Verteilung von RPA und Rad51 Foci in EC und HC Regionen, gemäß der EC und HC Chromatinanteile. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die Anzahl der Rad51 foci mit zunehmender Strahlendosis nicht weiter zunimmt sondern stagniert, welches eine Saturierung der HRR bei höheren Strahlendosen zeigt und unveröffentlichte Ergebnisse aus unserem Institut bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass die Saturierung der HRR unabhängig von dem Chromatin-Kondensation Status auftritt. Im Gegensatz dazu, zeigte die Analyse von RPA Foci, dass DNA End-Resektion nach höheren Strahlendosen nicht unterdrückt wird, sondern linear mit steigender Strahlendosis zunimmt. Dies impliziert einen Reparaturweg-Switch von fehlerfreier HRR zu fehleranfälligen Reparaturmechanismen nach höheren Strahlendosen. Die Analyse von 53BP1 Foci nach hohen Strahlendosen wies eine konstant bleibende Foci Anzahl zu späten Zeitpunkten nach Bestrahlung auf. Darüber hinaus, zeigten die Dosis-Wirkungs-Kurven von 53BP1 Foci, ähnlich zu Rad51 Foci, eine Saturierung nach höheren Strahlendosen. Die vergleichbaren Ergebnisse von Rad51 und 53BP1 Foci legen nahe, dass 53BP1 eine regulierende Rolle im Prozess der HRR-Saturierung spielt. Um die Doppelstrangbruch-Reparatur unter veränderter Chromatin-Kondensation zu untersuchen, wurden die Zellen mit hypertonischem oder hypotonischem Medium behandelt. Hypertone Behandlung bewirkt eine Erhöhung der Chromatin-Kondensation und die Beeinträchtigung der DSB-Reparatur. Obwohl wir in hypertonisch behandelten Zellen vergrößerte γH2AX Foci feststellen konnten, zeigte die nahezu ausbleibende Bildung von pATM, 53BP1, RPA und Rad51 Foci eine fast vollständig unterdrückte Doppelstrangbruch-Reparatur. Auf der anderen Seite zeigte die Behandlung mit hypotonischem Medium, die zu einer aufgelockerten Chromatinstrusktur führt, eine bessere Verträglichkeit mit Doppelstrangbruch-Reparaturwegen, da eine fast unveränderte Bildung von 53BP1, pATM und RPA Foci beobachtet werden konnte. Unerwarteterweise wurde die Bildung von γH2AX Foci in hypotonisch behandelten Zellen unterdrückt, welches zeigt, dass 53BP1 und RPA ohne umfangreiche Phosphorylierung von H2AX an der Bruchstelle akkumulieren können. Mit Hilfe von spezifischen Reparatur-Reporter-Assays konnte gezeigt werden, dass die HRR unter hypertonischen und hypotonischen Bedingungen der am stärksten beeinflusste Reparaturweg ist, welches eine sehr hohe Empfindlichtkeit der HRR gegenüber Änderungen der Chromatinstruktur zeigt. Auch die Hemmung der Histon-Methyltransferase SUV39H1 mit Chaetocin führte zu stark unterdrückter HRR. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unterstützen die vorherigen Erkenntnisse und zeigen eine HRR-Sättigung mit zunehmender Strahlendosis unabhängig von der Chromatinstruktur. Desweitern deuten die Ergebnisse der 53BP1 Foci stark auf eine Beteiligung von 53BP1 in dem Prozess der HRR-Saturierung hin, die eine regulatorische Rolle von 53BP1 in diesem Prozess vermuten lässt. Die Modifizierung von Chromatinstrukturen konnte erfolgreich etabliert werden und erwies sich als regulatorischer Parameter in der Aktivierung von HRR.

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Demond, Marilen: The influence of chromatin structure on DNA double strand break repair pathway choice. 2017.

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