DuEPublico 2

Dies ist unser neues Repositorium, derzeit für E-Dissertationen und ausgewählte weitere Publikationen. Weitere Informationen...

Calcium phosphate nanoparticles for medical application : drug and vaccine delivery

Rotan, Olga

In dieser Arbeit wurden Calciumphosphat-Nanopartikel synthetisiert, mit verschiedenen biologischen und synthetischen Molekülen funktionalisiert und hinsichtlich potenzieller Anwendungsmöglichkeiten in Bio- und Nanomedizin untersucht. Die Nanopartikel wurden mit unterschiedlichen Polyelektrolyten (PEI, CMC oder DNA) stabilisiert und mit Peptiden, Proteinen, Oligonukleotiden, Nukleinsäuren, Polymeren und anderen Molekülen beladen. Danach wurden die Partikel mittels unterschiedlichen physikalisch-chemischen Methoden charakterisiert. Die Menge an fluoreszenzmarkierten Molekülen, die auf der Oberfläche der Nanopartikel adsorbiert waren, wurde mit UV-Vis-Spektroskopie bestimmt. Um die zelluläre Aufnahme von beladenen Calciumphosphat-Nanopartikeln zu untersuchen, wurden in vitro-Versuche an HeLa, MG-63, THP-1 und hMSC Zellen durchgeführt. Licht- und Fluoreszenz-Mikroskopie sowie CLSM der Zellen zeigten eine effiziente Internalisierung von Molekülen zusammen mit den Calciumphosphat-Nanopartikeln. Im Gegensatz dazu waren gelöste Moleküle allein im Allgemeinen nicht in der Lage, die Zellmembran zu durchdringen. Darüber hinaus wurde durch die Verwendung verschiedener Inhibitoren an MG-63-Zellen festgestellt, dass die Nanopartikel durch Caveolin-vermittelte Endozytose aufgenommen wurden. Freie HTRA1-Proteinmoleküle hingegen gelangten durch die anderen Aufnahmewege in die Zellen, die noch zu bestimmen sind. Außerdem wurde am Beispiel des Lysozyms untersucht, wie das biologische Milieu die Aktivität eines enzymhemmenden Polymers beeinflusst. Calciumphosphat-Nanopartikel, wurden mit Lysozym-inhibierendem Polymer funktionalisiert. Nach 3 h Inkubation wurden sie von THP-1 Zellen aufgenommen, wie es auf CLSM-Aufnahmen von behandelten Zellen zu sehen war. Dennoch war die erwartete signifikante Hemmwirkung des Polymers sowohl innerhalb der lebenden Zelle als auch im Zellkulturmedium nicht vorhanden. Die durchgeführten Experimente in Phosphatpuffer, Zellkulturmedium mit und ohne FCS, mit freiem Polymer und Lysozym, und in Abwesenheit von Zellen sowie Nanopartikeln deuteten auf einen grundlegenden Einfluss der experimentellen Bedingungen hin. Die hemmende Wirkung des Polymers konnte im Fall der Phosphatpufferlösung in dosisabhängiger Weise deutlich festgestellt werden. Im Vergleich dazu konnte die Hemmung von Lysozym im Zellmedium nur bei der höchsten Polymer-Konzentration und nur bis zu 40% festgestellt werden. Außerdem ging die hemmende Wirkung gänzlich verloren, wenn das Zellkulturmedium mit 10% FCS ergänzt wurde. Dies könnte auf eine geringe Spezifität der hemmenden Polymermoleküle hindeuten, die offenbar mit anderen Biomolekülen, die in großen Mengen in biologischen Lösungen wie dem Zellkulturmedium enthalten sind, in Wechselwirkung treten könnten. Eine weitere Reihe von Experimenten wurde der Untersuchung der Calciumphosphat-Nanopartikel als potenziellem neuartigem Impfsystem gewidmet. Die Fähigkeit von Nanopartikeln, die mit immunoaktiven Molekülen wie CpG, Influenzavirus-Hämagglutinin oder von Friend Virus-abgeleiteten Proteinen beladen wurden, um eine Immunantwort zu stimulieren, wurden zunächst in vitro auf Antigenpräsentierenden dendritischen Zellen (DCs), CD4+ und CD8+ T-Zellen getestet. Diese funktionalisierten Nanopartikel riefen im Vergleich zu den Kontrollgruppen eine signifikant höhere Reifung der DCs hervor. Dadurch wurde die Proliferation von Virus-spezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen effektiv stimuliert. Zusätzlich zeigten die in vivo-Studien zur Immunisierung von Mäusen gegen Influenza-Virus und Friend-Virus (ein Retrovirus-Modell), dass die Nanopartikel eine Immunantwort aktivieren konnten und dazu beigetragen haben, die Viruslast in infizierten Mäusen deutlich zu verringern. Die signifikante Verbesserung der Immunantwort im Vergleich zur Immunisierung nur mit den löslichen immunaktiven Molekülen wurde nachgewiesen. Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass dieses auf Calciumphosphat-Nanopartikeln basierende Trägersystem vielseitige Anwendungsmöglichkeiten für Bio- und Nanomedizin bieten kann.

In this work, the synthesis, characterization, and application possibilities of calcium phosphate nanoparticles functionalized with various biological and synthetic molecules in bio- and nanomedicine were investigated. Nanoparticles stabilized with different polyelectrolytes (PEI, CMC, or nucleic acids) and loaded with peptides, proteins, oligonucleotides, nucleic acids, porphyrins, polymers, and other molecules were synthesized and characterized with different physicochemical methods. The number of fluorescently labeled cargo molecules adsorbed onto the surface of the nanoparticles were determined by UV-Vis spectroscopy. In order to study the cellular uptake of cargo-loaded calcium phosphate nanoparticles, in vitro experiments on HeLa, MG-63, THP-1 and hMSC cells were carried out. Light and fluorescence microscopy as well as CLSM imaging of the cells showed a high level of calcium phosphate nanoparticle internalization, regardless of the type of cargo molecule present in the nanoparticles. In contrast, dissolved molecules alone were usually not able to penetrate the cell membrane. Moreover, by using different inhibitors of endocytotic pathways on MG-63 cell line, it was observed that nanoparticles were taken up by caveolin-mediated endocytosis. Free protein molecules (HTRA1), however, used the routes other than endocytosis, which are yet to be determined. It was also investigated how the biological milieu influenced the activity of enzyme-inhibiting polymer on the example of lysozyme. Calcium phosphate nanoparticles, functionalized with lysozyme-inhibiting polymer, were taken up by THP-1 cell line within 3 h of incubation as it was demonstrated by confocal laser scanning microscopy of the treated cells. Nevertheless, the expected significant inhibitory effect of the polymer inside the living cells, as well as in the cell culture medium, was absent. The experiments in phosphate buffer, cell culture medium with and without FCS, with free polymer and lysozyme showed a dramatic impact of the experimental conditions on the effectiveness of the lysozyme-inhibitor polymer. The inhibitory effect of the polymer was clearly shown in phosphate buffer solution in a dose-dependent manner. In the presence of the cell culture medium containing various biological molecules, the inhibition of lysozyme decreased essentially and could be detected only at the highest concentration of polymer, and only up to 40%. Furthermore, when the cell culture medium was supplemented with 10% of FCS, no inhibitory effect was found. This may serve as evidence for the low specificity of the inhibitory polymer to target molecule. The polymer molecules interacted with other biomolecules contained in large quantities in cell culture media. Another set of experiments was dedicated to the investigation of calcium phosphate nanoparticles as potent vaccination tool. The ability of nanoparticles, loaded with immunoactive molecules like CpG, influenza virus hemagglutinin, and Friend virus-derived proteins to stimulate the immune response, were tested in vitro on antigen-presenting cells (DCs) and CD4+ and CD8+ T cells. These functionalized nanoparticles performed significantly effectively compared to control groups, driving the maturation of DCs and subsequent promotion of the proliferation of virus-specific CD4+ and CD8+ T cells. Furthermore, in vivo studies with immunization of mice against influenza virus and Friend virus, as a retroviral mouse model, showed that the nanoparticles were able to activate the immune response and helped to clear the viral load in infected mice better than in control groups where immunoactive molecules were injected in a soluble form. Summarizing, one can say that calcium phosphate-based nanoparticles can serve as an effective and biocompatible carrier system that can be used for many applications in bio- and nanomedicine.

Preview

Share and cite

Citation style:

Rotan, Olga: Calcium phosphate nanoparticles for medical application. drug and vaccine delivery. 2016.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export