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Molecular imprinting of polypyrrole for electrochemical sensing of clofibric acid

Schweiger, Bianca

Molecularly imprinted polymers (MIPs) are artificial biomimetic receptors with applications in separation ranging from small molecules to whole cells. The combination of the MIP principle with conducting polymers allows the fabrication of specific and selective layers for sensing purposes. Not only the robustness of MIPs against environmental conditions and their low cost compared with natural receptors are advantages of MIPs, but also the possibility to prepare them for compounds which have no natural receptors. In this work, piezoelectric quartz crystals and analogous gold substrates were electrochemically coated with molecularly imprinted conducting polypyrrole films for pulsed amperometric detection (PAD) of clofibric acid, a metabolite of the blood lipid regulator clofibrate. Usually clofibric acid is detected by using reversed-phase HPLC with spectrophotometric detection. This requires large instrumentation, ultrapure solvents, and suitable sample preparation. An electrochemical sensing method would be advantageous due to the simple setup and low cost, and the use of organic solvents for the detection could be avoided. The films were prepared by cyclic voltammetry of an aqueous solution containing pyrrole as monomer, clofibric acid or, for feasibility studies, caffeine as template, and potassium chloride, potassium nitrate, or phosphate buffer solution as conducting salt. Non-imprinted polymers (NIPs) were prepared without template under the same conditions. The electrodeposition was monitored by a quartz crystal microbalance combined with an electrochemical cell. The deposition was influenced by the number of cycles and the applied potential, by the monomer concentration and the type of conducting salt, and also by the presence of the template. Cyclic voltammetry data obtained during polymerization and deposited weight estimations revealed a decrease of the polymerization rate with increasing clofibric acid concentration. Template entrapment and template removal were studied with X-ray photoelectron spectroscopy. The results indicated that clofibric acid could be removed after imprinting with an aqueous ethanol solution. Binding of caffeine and clofibric acid was studied with PAD. The results showed that optimizations of the washing procedure were needed. Washing procedures under stirring with frequent solvent change were tested with methanol, ethanol, and variation of the washing time, and were compared with washing by PAD measurements. In binding experiments, the highest sensor response to clofibric acid was obtained with sensors treated by PAD washing although the sensor response decreased gradually with repeated washing/measurement cycles. MIP and NIP surfaces were studied with atomic force microscopy (AFM), ellipsometry, contact angle measurements, and zeta potential measurements. AFM measurements revealed smooth surfaces with roughnesses of 6–8 nm for imprinted and non-imprinted layers. Differences between MIP and NIP layers were revealed by contact angle and zeta potential measurements. The results showed that contact angles were higher for MIPs than for NIPs and that the isoelectric point was lower for MIPs than for NIPs. Binding experiments with clofibric acid and other substances showed a pronounced selectivity of the MIP for clofibric acid vs. carbamazepine, but the response of MIP and NIP to the structurally related molecule 2,4-dichlorophenoxyacetic acid was higher than the response to clofibric acid. The smooth surface might be a reason for an excessively low density of specific binding sites for clofibric acid. Additionally to cyclic voltammetry, the application of potential pulses during polymerization was tested. Compared with cyclic voltammetry, the use of potential pulses resulted in more adherent films, which allowed testing the application of a negative potential as washing method. To introduce functional groups into the polymer, which could build more non-covalent bonds with the template during polymerization, pyrrole propionic acid and 2-(1H-pyrrole-1-yl)ethanamine were tested as monomers. Successful polymerization was obtained by copolymerization with pyrrole. The feasibility of sensor fabrication with a combination of molecular imprinting and electrochemical deposition of polypyrrole for the detection of clofibric acid could be demonstrated, but the specificity (response for MIP vs. NIP) and selectivity were strongly dependent on preparation and washing conditions.

Molekular geprägte Polymere (molecularly imprinted polymers, MIPs) sind künstliche biomimetische Rezeptoren, die zu Trennungszwecken für verschiedene Substanzen, von kleinen Molekülen bis hin zu ganzen Zellen, entwickelt werden können. Die Kombination des MIP-Prinzips mit leitfähigen Polymeren erlaubt die Entwicklung spezifischer und selektiver Schichten zu Messzwecken. Nicht nur die Widerstandsfähigkeit der MIPs gegen Umwelteinflüsse und ihre niedrigen Herstellungskosten im Vergleich zu natürlichen Rezeptoren gehören zu ihren Vorteilen, sondern auch die Möglichkeit, MIPs für Substanzen herzustellen, für die es keine natürlichen Rezeptoren gibt. In dieser Arbeit wurden goldbeschichtete piezoelektrische Quarzkristalle und Glassubstrate elektrochemisch mit molekular geprägten leitfähigen Polypyrrolfilmen für die amperometrische Detektion von Clofibrinsäure, einem Metaboliten des Blutfettsenkers Clofibrat, beschichtet. Gewöhnlich wird Clofibrinsäure spektrophotometrisch mittels reversed-phase HPLC detektiert. Dies erfordert aufwändige Instrumentierung, hochreine Lösungsmittel und eine geeignete Probenvorbereitung. Der Vorteil einer elektrochemischen Methode wäre der mit niedrigen Kosten verbundene einfache Aufbau der Messanordnung und die Möglichkeit, den Einsatz organischer Lösungsmittel vermeiden zu können. Die Filme wurden mittels Zyklovoltammetrie in wässriger Lösung bestehend aus Pyrrol als Monomer, Clofibrinsäure oder, für erste Machbarkeitsstudien, Koffein als Templat und Kaliumchlorid, Kaliumnitrat oder Phosphatpufferlösung als Leitsalz hergestellt. Nicht-geprägte Polymere (non-imprinted polymers, NIPs) wurden ohne Templatzusatz unter ansonsten gleichen Bedingungen hergestellt. Die elektrochemische Beschichtung der Sensoroberfläche wurde durch die Kombination der elektrochemischen Zelle mit einer Quarzkristallmikrowaage beobachtet. Die Abscheidung des Polymers wurde durch die Anzahl der Zyklen und das verwendete Potential, die Konzentration des Monomers und der Art des Leitsalzes sowie durch das Templat beeinflusst. Zyklovoltammetrische Messwerte, die während der Polymerisation erhalten wurden, und Abschätzungen der Polymermasse zeigten, dass mit steigender Konzentration an Clofibrinsäure die Polymerisationsrate sinkt. Der Einschluss und die Entfernung der Templatmoleküle wurden mit Röntgenphotonenspektroskopie untersucht. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Clofibrinsäure mit ethanolischer Lösung aus dem Polymer entfernt werden konnte. Bindungsversuche mit Koffein und Clofibrinsäure wurden mit gepulster amperometrischer Detektion (pulsed amperometric detection, PAD) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vorgehen zur Templatentfernung optimiert werden sollte. Waschmethoden unter Rühren mit regelmäßigem Wechsel des Lösungsmittels wurden mit Methanol, Ethanol und Veränderung der Waschzeit getestet und mit Waschen durch PAD verglichen. Die höchste Sensorantwort auf Clofibrinsäure in Bindungsversuchen wurde mit Sensoren, die mittels PAD gewaschen worden waren, erreicht, doch die Sensorantwort nahm mit zunehmender Zahl an Wasch- und Bindungsversuchen ab. Die Oberflächen der MIPs und NIPs wurden mit Rasterkraftmikroskopie (atomic force microscopy, AFM), Ellipsometrie, Kontaktwinkelmessungen und Zeta-Potentialmessungen untersucht. AMF-Messungen ergaben mit 6–8 nm eine geringe Rauigkeit der Oberflächen von MIPs und NIPs. Unterschiede zwischen MIPs und NIPs zeigten sich bei Kontaktwinkel- und Zeta-Potentialmessungen. Für MIPs wurden höhere Kontaktwinkel als für NIPs festgestellt. Weiterhin lag der isoelektrische Punkt von MIPs niedriger als der von NIPs. Bindungsversuche mit Clofibrinsäure und anderen Substanzen zeigten eine höhere Selektivität der MIPs für Clofibrinsäure im Vergleich zu Carbamazepin, aber die Sensorantwort von MIPs und NIPs auf das strukturell ähnliche Molekül 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure war höher als die Sensorantwort auf Clofibrinsäure. Zusätzlich zur Zyklovoltammetrie wurde die Verwendung von Potentialpulsen als Polymerisationsmethode getestet. Im Vergleich zur Zyklovoltammetrie ergab die Verwendung von Potentialpulsen Filme, die stärker an der Goldoberfläche der Sensoren hafteten, was die Verwendung eines negativen Potentials als Waschmethode zur Entfernung des Templats erlaubte. Zur Einführung funktioneller Gruppen in das Polymer, welche die Anzahl nicht-kovalenter Bindungen zwischen Templat und Polymer erhöhen könnten, wurden Pyrrolpropionsäure und 2-(1H-Pyrrol-1-yl)ethanamin als Monomere getestet. Eine Polymerisation wurde durch Copolymerisation mit Pyrrol erreicht. Die Machbarkeit der Sensorherstellung mit einer Kombination aus molekularer Prägung und elektrochemischer Polymerisation von Polypyrrol zur Detektion von Clofibrinsäure konnte gezeigt werden, aber Spezifität und Selektivität hingen stark von den Herstellungs- und Waschbedingungen ab.

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Schweiger, Bianca: Molecular imprinting of polypyrrole for electrochemical sensing of clofibric acid. 2016.

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